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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 263 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Neuralrohrverschluss (NTC) ist ein komplexer Prozess der Embryonalentwicklung, an dem molekulare, zelluläre und biomechanische Mechanismen beteiligt sind. Während die genetischen Faktoren und die biochemische Signalübertragung umfassend untersucht wurden, ist die Rolle der Gewebebiomechanik aufgrund fehlender Werkzeuge noch weitgehend unerforscht. Hier haben wir eine optische Modalität entwickelt, die eine mechanische Zeitrafferbildgebung des Neuralplattengewebes durchführen kann, während der Embryo eine Neurulation erfährt. Diese Technik basiert auf der Kombination eines konfokalen Brillouin-Mikroskops und einer modifizierten Ex-ovo-Kultivierung von Hühnerembryonen mit einem Inkubator auf der Bühne. Mit dieser Technik haben wir zum ersten Mal die mechanische Entwicklung des Neuralplattengewebes bei lebenden Embryonen erfasst. Insbesondere beobachteten wir den kontinuierlichen Anstieg des Gewebemoduls der Neuralplatte während der NTC bei ex ovo kultivierten Embryonen, was mit den Daten der in ovo Kultur sowie früheren Studien übereinstimmt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass der Anstieg des Gewebemoduls stark mit der Gewebeverdickung und -biegung korrelierte. Wir gehen davon aus, dass diese berührungslose und markierungsfreie Technik neue Möglichkeiten eröffnet, die biomechanischen Mechanismen in der Embryonalentwicklung zu verstehen.

Der Neuralrohrverschluss (NTC) ist ein zentrales Verfahren der Wirbeltierneurulation, bei dem die ebene Neuralplatte angehoben und zu einem hohlen Neuralrohr verschmolzen wird. Ein Scheitern dieses Verfahrens kann zu schweren Neuralrohrdefekten führen, die zu den häufigsten Geburtsfehlern beim Menschen zählen1. Genetische und molekulare Prozesse, die NTC steuern, werden seit vielen Jahrzehnten eingehend untersucht2,3,4. Andererseits erregen biomechanische Mechanismen, die möglicherweise an NTC beteiligt sind, in den letzten Jahren zunehmend Aufmerksamkeit5,6,7. Auf Zell- und Gewebeebene kann die Morphogenese des Neuralrohrs als Ergebnis der Wechselwirkung zwischen der erzeugten Kraft und dem mechanischen Widerstand des embryonalen Gewebes betrachtet werden8,9: Der erfolgreiche Verschluss des Neuralrohrs erfordert, dass die intrinsische Kraft dies kann Überwinden Sie die entgegenwirkende Gewebespannung, die auf seiner elastischen Eigenschaft beruht. Daher kann die Veränderung der Gewebebiomechanik zu einem Versagen des Verschlusses und damit zu einer Fehlbildung des Neuralrohrs führen10. Obwohl die Krafterzeugung und die mechanische Veränderung des Gewebes während des NTC-Eingriffs in Experimenten beobachtet wurden10,11,12, bleibt der quantitative Beitrag spezifischer biomechanischer Prozesse zur Gewährleistung einer robusten Neurulation weitgehend unbekannt. Einer der Hauptgründe ist das Fehlen von Werkzeugen, die die Biomechanik des Nervenplattengewebes in situ und in Echtzeit während der Entwicklung des Embryos abbilden können.

Viele wichtige Techniken wurden entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften von embryonalem Gewebe zu quantifizieren13, die ungefähr in drei Kategorien eingeteilt werden können: (1) kontaktbasierte Techniken, einschließlich Rasterkraftmikroskopie (AFM)14,15 oder Mikrocantilever11,16,17 basierte Einkerbungen zum Messen des scheinbaren Elastizitätsmoduls im nm- bis µm-Maßstab, Mikropipettenaspiration zum Messen der Gewebespannung im µm-Maßstab18 und Zugtest des Gewebes im ~mm-Maßstab19. Während die kontaktbasierten Techniken eine direkte Quantifizierung der viskoelastischen Eigenschaften des Gewebes unter quasistatischen oder niederfrequenten Bedingungen ermöglichen können, benötigen sie physischen Zugang zur Probe und müssen Kraft aufbringen, um die Probe während der Messung zu verformen. Da Neuralrohrgewebe in 3D eine unregelmäßige Form aufweist und mechanisch miteinander verbunden ist, sind für eindeutige mechanische Tests in der Regel isolierte Explantate erforderlich. (2) Sensoren auf Perlen-/Tröpfchenbasis, einschließlich optischer/magnetischer Pinzette20,21 und Mikrotröpfchen22. Die optische/magnetische Pinzette verwendet kraftbetriebene starre Kügelchen (ca. µm Durchmesser), um die rheologischen Eigenschaften von lokalisiertem Gewebe zu erfassen, und Mikrotröpfchen verwenden verformbare Tröpfchen (4–80 µm Durchmesser), um die Gewebespannung zu quantifizieren. Diese Sensoren können nach sorgfältiger Kalibrierung die mechanischen Eigenschaften mit subzellulärer oder zellulärer Auflösung quantitativ messen. Sie erfordern jedoch die Injektion von Kügelchen oder Tröpfchen in das Gewebe, was sie invasiv und mit geringem Durchsatz macht. (3) Gewebeablation/-dissektion. Bei dieser Methode wird entweder ein ultraschneller gepulster Laserstrahl10 oder eine Klinge23 verwendet, um einen Teil des Gewebes zu präparieren und die Gewebespannung anhand der Entspannungsreaktion zu bewerten. Aufgrund der einfachen Einrichtung ist dies eine attraktive Technik. Aufgrund der mechanischen Verbindung von embryonalem Gewebe in 3D ermöglicht diese Methode jedoch meist eine globale Beurteilung in relativ großem Maßstab (~ 100 µm bis ~ mm Größe). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bestehende Methoden verschiedene Aspekte der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Gewebe auf unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Skalen quantifizieren können und die Beurteilung der Biomechanik embryonaler Gewebe erheblich vorangebracht haben. Aufgrund der technischen Einschränkungen wurde jedoch nicht über die mechanische In-situ-Kartierung des Neuralplattengewebes während des NTC-Verfahrens bei lebenden Embryonen berichtet.

Die konfokale Brillouin-Mikroskopie ist eine neue Technik zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften biologischer Materialien24,25,26. Anders als herkömmliche mechanische Prüfmethoden verwendet die Brillouin-Mikroskopie einen Laserstrahl, um die elastischen Eigenschaften des Materials zu messen. Dies basiert auf einem optischen Phänomen namens spontane Brillouin-Lichtstreuung27, bei dem die Wechselwirkung des einfallenden Laserstrahls und des inhärenten akustischen Phonons innerhalb des Materials eine Frequenzverschiebung (d. h. Brillouin-Verschiebung) in das gestreute Licht einführt (siehe „Methoden“). . Durch die Messung der Brillouin-Verschiebung des Streulichts mit einem maßgeschneiderten Spektrometer kann der elastische Längsmodul des Materials direkt quantifiziert werden. Da das Brillouin-Mikroskop in einer konfokalen Konfiguration konzipiert ist, kann es eine beugungsbegrenzte räumliche Auflösung erreichen. In den letzten Jahren haben wir diese Technik weiterentwickelt und ihre Machbarkeit zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen28,29, embryonalen Gewebes30 und Nervenplatten31 mit subzellulärer Auflösung und ausreichender mechanischer Empfindlichkeit nachgewiesen. Als rein optische Technik kann das Brillouin-Mikroskop die Biomechanik berührungslos, nicht-invasiv und markierungsfrei messen. Daher könnte es ein vielversprechendes Werkzeug zur Kartierung der elastischen Eigenschaften von Neuralplattengewebe in situ während der Embryonalentwicklung sein.

In dieser Arbeit haben wir eine optische Modalität entwickelt, die eine mechanische Zeitrafferbildgebung von NTC im Hühnerembryo durchführen kann. Zu diesem Zweck haben wir ein konfokales Brillouin-Mikroskop mit einem Inkubator auf der Bühne für die modifizierte Ex-Ovo-Kultivierung integriert. Die Ex-Ovo-Kultur stellt sicher, dass sich der Embryo über einen Zeitraum von 21 Stunden kontinuierlich weiterentwickelt und das gesamte NTC-Ereignis abdeckt. Im Vergleich zur In-Ovo-Kultur, bei der sich der Embryo in einer undurchsichtigen Eischale entwickelt, bietet die Ex-Ovo-Kultur eine bessere optische Zugänglichkeit und ermöglicht so Echtzeit-Hellfeld- und Brillouin-Bildgebung während der Entwicklung des Embryos. Anschließend verwendeten wir die Brillouin-Mikroskopie, um kontinuierlich mechanische 2D-Bilder des kranialen Neuralplattengewebes aufzunehmen, während der Embryo eine Neurulation erfuhr. Mit dieser Modalität beobachteten wir einen deutlichen Anstieg der durchschnittlichen Brillouin-Verschiebung des Neuralplattengewebes während der NTC des ex ovo kultivierten Hühnerembryos, was mit den Ergebnissen des in ovo Kultivierungssystems übereinstimmt. Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass die Zunahme des Gewebemoduls auf der dorsal-ventralen Achse stark mit der Verdickung der Neuralplatte sowie dem Schließwinkel korreliert, was darauf hindeutet, dass die Gewebemechanik mit der geometrischen Veränderung der Neuralplatte synchronisiert werden könnte, um eine zu erreichen erfolgreicher Verschluss des Neuralrohrs. Zusammen kann diese mechanische Zeitraffer-Bildgebungsmodalität neue Daten zum Verständnis der biomechanischen Mechanismen während der embryonalen Neurulation liefern.

Die mechanische 2D-Bildgebung im Zeitraffer wurde mit einem inversen Brillouin-Mikroskop durchgeführt (Abb. 1a) (siehe „Methoden“). Per Definition ist die Brillouin-Verschiebung durch Materialeigenschaften wie Brechungsindex \(n\) und Dichte \(\rho\) positiv mit dem Längsmodul verknüpft. Bei biologischen Materialien ist das Verhältnis von Brechungsindex und Dichte \(\rho /{n}^{2}\) während physiologischer Prozesse annähernd konstant24,32. Daher haben wir hier die Brillouin-Verschiebung verwendet, um die relative Änderung des Längsmoduls zu interpretieren. In der modifizierten Ex-Ovo-Kultur wurde der Embryo mit der Rückenseite nach unten in eine Petrischale gelegt (Abb. 1b). Die Schale wurde dann in den Inkubator auf der Bühne gestellt, um die Entwicklung des Embryos aufrechtzuerhalten (> 21 Stunden). Die Zeitraffer-Hellfeldbilder lassen darauf schließen, dass sich die Embryonen aus der Ex-Ovo-Kultur mit einer ähnlichen Zeitrate entwickelt haben wie die Embryonen aus der In-Ovo-Kultur (Ergänzende Abbildungen S1–S2).

Schematische Darstellung des Aufbaus. (a) Konfokales Brillouin-Mikroskop mit Inkubator auf der Bühne. QWP-Viertelwellenplatte, polarisierter PBS-Strahlteiler, FC-Faserkoppler. (b) Trägerschale für Ex-Ovo-Kultur. Die Seitenansicht (oben) und die Draufsicht (unten) zeigen alle Komponenten einschließlich des Embryos im Träger.

Um mögliche Auswirkungen der Ex-Ovo-Kultur und der Laserbeleuchtung auf die Gewebemechanik der Neuralplatte auszuschließen, haben wir in Ovo kultivierte Embryonen (N = 46) in verschiedenen Hamburger Hamilton (HH)-Stadien (HH 6 bis HH 12) gesammelt Erfasste mechanische 2D-Bilder des Querschnitts senkrecht zur anterior-posterioren Achse (nahe der Schädelregion). Die repräsentativen Brillouin-Bilder legen nahe, dass die Neuralplatte des Embryos in späteren HH-Stadien eine stärkere Brillouin-Verschiebung aufweist als frühere Stadien (Abb. 2a – d). Anschließend haben wir die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung der Neuralplattenregion an einer ähnlichen Stelle der Anterior-Posterior-Achse für alle gesammelten Embryonen quantifiziert. Wir beobachteten, dass die Brillouin-Verschiebung der Neuralplatte einen deutlichen Anstieg von HH 6 auf HH 9+ zeigte und danach ungefähr ihren Wert beibehielt (Abb. 2e). Die Neuralplatte von Embryonen im Spätstadium (d. h. HH 12) weist eine durchschnittliche Brillouin-Verschiebung von 6,353 GHz auf, was 0,126 GHz höher ist als die von Embryonen im frühen Stadium (d. h. HH 6), was einer Steigerung von ~ 60 % gegenüber Young entspricht Modul gemäß der empirischen Beziehung zwischen Längsmodul und Young-Modul aus Zellen28 (siehe „Methoden“).

Ergebnisse von in ovo kultivierten Embryonen. (a–d) Repräsentative Brillouin-Bilder von kranialem Neuralrohrgewebe von vier Embryonen in verschiedenen HH-Stadien: (a) HH 6, (b) HH 8, (c) HH 11, (d) HH 12. Die rote gestrichelte Linie umreißt die Neuralplattenregion. (e) Die durchschnittlichen Brillouin-Verschiebungen der kranialen Neuralplatte von Embryonen zeigen einen kontinuierlichen Anstieg des Gewebemoduls im Vergleich zum Entwicklungsstadium. Anzahl der Embryonen: 46. Jeder Punkt stellt die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung eines Embryos dar. Der Maßstabsbalken beträgt 50 µm.

Um die mechanische Entwicklung der Neuralplatte während des gesamten NTC-Verfahrens zu erfassen, führten wir eine mechanische Zeitrafferkartierung ex ovo kultivierter Embryonen durch. Der Embryo wurde mehr als 14 Stunden lang kontinuierlich kultiviert (ergänzende Abbildung S3), wobei das Zeitraffer-Brillouin-Bild des Neuralplattenquerschnitts im Hinterhirn-/Halsbereich (Abb. 3a) am dritten Somitenpaar aufgenommen wurde entlang der sich entwickelnden Neuralplatte (Ergänzende Abbildung S3). Die Ergebnisse zeigen, dass die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung der Neuralplatte mit der Kultivierungszeit kontinuierlich zunimmt (Abb. 3b), was mit dem Ergebnis von in ovo kultivierten Embryonen übereinstimmt. Wiederholte Experimente (N = 9) legen nahe, dass die Zunahme der Brillouin-Verschiebung der Neuralplatte während der NTC ein häufiges Phänomen bei Hühnerembryonen ist (Abb. 3d). Insbesondere nahm die Brillouin-Verschiebung der Neuralplatte von HH 8- auf HH 9 signifikant zu und veränderte sich danach geringfügig. Am Endpunkt der Ex-ovo-Kultur (HH 10) weisen die Neuralplatten eine durchschnittliche Brillouin-Verschiebung von 6,336 GHz auf, was 0,097 GHz höher ist als im frühesten Stadium (HH 8-), was einem relativen Anstieg von ~ 46 % entspricht. in Bezug auf den Elastizitätsmodul. Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis von in ovo kultivierten Embryonen und bestätigt, dass die ex ovo Kultur und die Laserbeleuchtung keinen Einfluss auf die mechanische Entwicklung des Neuralplattengewebes während der Embryonalentwicklung hatten.

Zeitraffer-Brillouin-Bildgebung ex ovo kultivierter Embryonen. (a) Zeitraffer-Brillouin-Bilder eines repräsentativen Embryos für 14 Stunden. (b) Die durchschnittliche Brillouin-Verschiebung des Neuralplattengewebes des Embryos in (a) nimmt mit der Kultivierungszeit zu. (c) Die Dicke des Nervenplattengewebes des Embryos in (a) nimmt mit der Kultivierungszeit zu. (d) Bei allen Embryonen (N = 9) wird eine Zunahme der Brillouin-Verschiebung gegenüber dem Entwicklungsstadium beobachtet. (e) Bei allen Embryonen wird eine Gewebeverdickung gegenüber dem Entwicklungsstadium beobachtet. (f) Korrelation zwischen der durchschnittlichen Brillouin-Verschiebung und der Dicke des Neuralplattengewebes. Symbole stellen verschiedene Embryonen dar. Anzahl der Messungen: 39. Zur Quantifizierung der statistischen Signifikanz wird der t-Test bei zwei Stichproben verwendet. *p = 0,008; **p = 0,012; ***p = 0,049; ****p = 0,01. Der Maßstabsbalken beträgt 50 µm.

Mithilfe der Gewebemechanik als Kontrastmechanismus in der Brillouin-Bildgebung können wir auch die morphologischen Veränderungen der Neuralplatte während der NTC quantifizieren. Hier haben wir die durchschnittliche Dicke der beiden Stellen gemessen, die in der Mitte des Abstands zwischen dem mittleren Gelenkpunkt und den Nervenspitzen liegt (Abb. 3c). In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Literatur2,33 beobachteten wir eine vierfache Verdickung der Neuralplatte von HH 8- (~ 13 µm) bis HH 9 (~ 52 µm) (Abb. 3e). Interessanterweise stellten wir fest, dass die Gewebeverdickung und der Anstieg des Gewebemoduls während des NTC-Eingriffs sehr ähnliche Trends aufweisen. Anschließend haben wir die Brillouin-Verschiebung gegen die Dicke für alle ex ovo kultivierten Embryonen aufgetragen und eine starke Korrelation (\(p<1\times {10}^{-6}\)) zwischen der Zunahme der Brillouin-Verschiebung und der Gewebeverdickung festgestellt (Abb. 3f). Diese Daten legen nahe, dass der Anstieg des Gewebelängsmoduls und die Gewebeverdickung wahrscheinlich zeitlich koordinierte Ereignisse während der NTC sind.

NTC ist ein komplexer biomechanischer Prozess der Gewebeformung und -strukturierung, der durch Kraft und mechanische Eigenschaften des Gewebes gesteuert wird. Daher ist es grundsätzlich notwendig, den Zusammenhang zwischen Gewebemechanik und -geometrie zu verstehen. Hier haben wir empirisch beobachtet, wie der Anstieg des Gewebemoduls mit der geometrischen Veränderung der Neuralplatte koordiniert wird. Gemäß den Brillouin-Bildern haben wir den Schließwinkel \(\beta\) als den Schnittpunkt der linken und rechten Seite der Neuralplatte am mittleren Gelenkpunkt definiert (Abb. 4a). Basierend auf der Definition bedeuten \(\beta =180^\circ\) und 0°, dass die Neuralplatte flach bzw. vollständig geschlossen ist. Als nächstes verteilten wir ex ovo kultivierte Embryonen (Entwicklungsstadien zwischen HH8 und HH10) auf jedes 10-Grad-Intervall und berechneten die Durchschnittswerte für jedes Intervall mit mehreren Embryonen. Anschließend haben wir die Brillouin-Verschiebung \({\omega }_{B}\) gegen den Schließwinkel \(\beta\) aufgetragen (Abb. 4b). Die Daten können durch eine einfache empirische Kurve \({\omega }_{B}=A\cdot \mathrm{exp}\left(B\cdot \beta \right)+C\) mit angepassten Parametern gut angepasst werden. (A=-0,024, B=7,85\times {10}^{-3},\) \(C=6,348\) und der Anpassungskoeffizient \({R}^{2}=0,67\). Diese positive Korrelation legt nahe, dass der Anstieg des Gewebemoduls wahrscheinlich mit der Biegung der Neuralplatte während des NTC-Eingriffs synchronisiert ist. Beachten Sie, dass diese Analyse keine Embryonen berücksichtigte, die älter als HH 8 oder später als HH 10 waren. In diesen Stadien könnte die Gewebemechanik bei demselben Schließwinkel (180° oder 0°) unterschiedlich sein. Da das Brillouin-Mikroskop eine konfokale Konfiguration hat, wird der Streuwinkel durch die Biegung der Neuralplatte nicht beeinflusst; Daher haben wir die potenziellen Artefakte ausgeschlossen, die durch die Biegung des Gewebes zu der beobachteten Zunahme der Brillouin-Verschiebung führen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den zugrunde liegenden biologischen Mechanismus zu verstehen, der den Anstieg des Gewebemoduls und der Biegung koordiniert.

Die Zunahme der Brillouin-Verschiebung korreliert mit der Gewebebiegung bei ex ovo kultivierten Embryonen. (a) Definition des Schließwinkels. (b) Der Schließwinkel korreliert mit der durchschnittlichen Brillouin-Verschiebung der Neuralplatte. Es werden Daten von Embryonen in den Entwicklungsstadien HH 8 bis HH 10 gesammelt. \(\beta =180^\circ\) und 0° bedeuten, dass die Neuralplatte flach bzw. vollständig geschlossen ist. Die Embryonen werden basierend auf dem Schließwinkel in jedem 10°-Intervall verteilt. Der Datenpunkt stellt den Durchschnittswert der Embryonen innerhalb desselben Intervalls dar. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. Eine durchgezogene Kurve ist das passende Ergebnis einer empirischen Funktion.

Hier haben wir eine optische Modalität für die mechanische Zeitrafferkartierung lebender Hühnerembryonen entwickelt. Diese Modalität basiert auf der Kombination eines konfokalen Brillouin-Mikroskops und eines modifizierten Ex-Ovo-Kultivierungssystems, das über subzelluläre Auflösung und ausreichende mechanische Empfindlichkeit verfügt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken für mechanische Tests nutzte unsere Methode einen fokussierten Laserstrahl zur Quantifizierung der Gewebemechanik und machte sie berührungslos, nicht-invasiv und markierungsfrei. Wir haben bestätigt, dass die Ex-Ovo-Kultur und die Laserbeleuchtung die Entwicklung des Embryos nicht störten. Wir haben die Machbarkeit dieser Technik demonstriert, indem wir in situ 2D-mechanische Bilder der Neuralplatte aufgenommen haben, während der Embryo eine Neurulation erlebte. Wir fanden heraus, dass das Gewebe der Neuralplatte während der NTC einen kontinuierlichen Anstieg des Gewebemoduls erfuhr. Bei anderen Arten wurde bereits über eine Gewebeversteifung während der Neurulation berichtet. Beispielsweise erhöhte sich der Elastizitätsmodul des Neuroepithels von Axolotl-Embryonen vom Stadium 13 bis zum Stadium 1519 um ein Faktor. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass das dorsale Nervengewebe im frühen Xenopus-Embryo vom Stadium 11,5 bis zum Stadium 2111 um fast das Vierfache zunahm. Kürzlich Die vorläufigen Studien an Mausembryonen deuten auf einen bis zu 80 %igen Anstieg des Gewebemoduls während der Neurulation mittels Brillouin-Mikroskopie hin31,34. Obwohl diese Daten aufgrund der Unterschiede bei den Arten und/oder den verwendeten Techniken nicht direkt mit dieser Arbeit vergleichbar sind, deutet der ähnliche Trend, der bei Hühnerembryonen beobachtet wurde, darauf hin, dass die Gewebebiomechanik bei NTC zwischen verschiedenen Arten eine wichtige Rolle spielen könnte. Der Anstieg des Gewebemoduls wird wahrscheinlich durch die erhöhte Zelldichte und/oder die Akkumulation der Actomyosin-Kontraktilität verursacht10,11,15, was in zukünftigen Arbeiten untersucht werden sollte. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass der Anstieg des Gewebemoduls stark mit der Gewebeverdickung und -biegung korreliert.

Neurulation ist ein komplexer Prozess, der zelluläre, molekulare und biomechanische Aktivitäten umfasst9,36. Während die genetische Regulation und die biochemische Signalübertragung ausführlich untersucht wurden, ist der biomechanische Mechanismus weniger erforscht und der zugrunde liegende Zusammenhang zwischen mikroskopischen zellulären/molekularen Aktivitäten und makroskopischer Morphogenese ist größtenteils unbekannt5. Da unsere rein optische Technik die 2D/3D-Gewebemechanik in intakten lebenden Embryonen direkt quantifizieren kann, kann sie möglicherweise neue Möglichkeiten eröffnen, die Rolle biomechanischer Mechanismen im NTC-Verfahren besser zu verstehen. Beispielsweise können einige entscheidende zelluläre Aktivitäten, darunter konvergente Ausdehnung37, apikale Verengung38 und interkinetische Kernmigration39,40, zusammen den beobachteten Anstieg der Brillouin-Verschiebung, -Verdickung und -Biegung koordinieren. Die subzelluläre Auflösung des Brillouin-Mikroskops wird es Forschern ermöglichen, die Rolle dieser zellulären Verhaltensweisen bei der Regulierung der Gewebebiomechanik weiter zu untersuchen. Andererseits können die mechanischen Signale das Zellverhalten und das Zellschicksal durch Mechanotransduktion während der Embryonalentwicklung steuern36,41; Daher kann die Technik dabei helfen, die Wechselwirkung zwischen biochemischen Signalen und biomechanischen Hinweisen zu verstehen. Darüber hinaus wird der Verschluss des Neuralrohrs physikalisch sowohl durch die erzeugte Kraft als auch durch den mechanischen Widerstand des Gewebes vorangetrieben10,12,42. Die In-situ-Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften kann dazu beitragen, die Rollen der Kraft und der Gewebemechanik zu entkoppeln und so eine bessere Aufklärung der biomechanischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ist die Computermodellierung ein leistungsstarkes Werkzeug zum Verständnis des Mechanismus der Morphogenese43,44,45. Die mit unserer Technik aufgenommenen mechanischen Zeitrafferbilder des Neuralplattengewebes können neue Eingabedaten für die Simulation der Neurulation liefern.

Neuralrohrdefekte (NTDs) gehören zu den häufigsten Geburtskrankheiten des Menschen und werden sowohl durch genetische als auch umweltbedingte Faktoren reguliert46,47. Auf Gewebeebene entstehen NTDs durch das physikalische Versagen des Neuralrohrs aufgrund des abnormalen Zusammenspiels von Krafterzeugung und den mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebes. Jüngste Arbeiten legen nahe, dass die durch Genmutation induzierte NTD mit einer veränderten Gewebebiomechanik verbunden ist10. Daher sollte ein quantitatives Instrument zur Messung der Gewebemechanik es Forschern ermöglichen, verschiedene NTDs auf spezifische Fehlregulationen zellulärer Mechanismen zurückzuführen, die das Versagen des Gewebeverschlusses verursachen, was die Lücke zwischen genetischen/umweltbedingten Faktoren und Gewebebiomechanik schließen und zur Prävention beitragen könnte Krankheiten.

Es ist erwähnenswert, dass sich der hochfrequente Längsmodul, der mit der Brillouin-Technik gemessen wird, per Definition vom niederfrequenten oder quasistatischen Young-Modul unterscheidet, der mit herkömmlichen Methoden wie AFM gemessen wird. Bei vielen biologischen Materialien wurde jedoch festgestellt, dass sich die beiden Module als Reaktion auf biologische Aktivitäten in die gleiche Richtung ändern48,49. Daher könnte man bei sorgfältiger Kalibrierung für bestimmte Materialien die Brillouin-Daten anhand des Elastizitätsmoduls interpretieren. In dieser Arbeit haben wir die Brillouin-Verschiebung verwendet, um die relative Änderung des Gewebemoduls abzuschätzen, indem wir davon ausgegangen sind, dass das Verhältnis von Dichte und Brechungsindex (\(\rho /{n}^{2}\)) konstant ist. Um den von Brillouin abgeleiteten Modul direkt zu quantifizieren, kann die Brillouin-Mikroskopie mit anderen Techniken kombiniert werden, mit denen die Dichte und/oder der Brechungsindex gemessen werden können50. Mit zunehmender Bildtiefe nimmt die Stärke des Brillouin-Signals je nach Transparenz des Gewebes ab. Bei Hühnerembryonen beträgt die maximale Eindringtiefe unseres Instruments etwa 200 µm. Eine weitere Verbesserung kann durch den Einsatz einer Laserquelle mit längerer Wellenlänge oder einer Wellenfrontkorrekturtechnik auf Basis adaptiver Optik51 erreicht werden. Die beobachtete untere Brillouin-Verschiebung an der Grenze der Neuralplatte in Abb. 2 und 3 ist wahrscheinlich ein Artefakt des Experiments. In der konfokalen Konfiguration ist die Brillouin-Verschiebung an jedem Pixel der Durchschnitt aller Brillouin-Signale vom fokussierten Strahlfleck (Voxel). Da der Strahlfleck an der Grenze der Neuralplatte teilweise mit umgebendem Medium und/oder Mesoderm gefüllt ist, das eine geringere Brillouin-Verschiebung aufweist, führt der Mittelungseffekt zu einer Verringerung der endgültigen Brillouin-Verschiebung. Dieser Effekt kann durch die Verwendung eines Objektivs mit hoher NA zusammen mit der Datennachbearbeitung gemildert werden35.

Befruchtete weiße Livorno-Eier wurden von der Geflügelfarm der University of Connecticut gekauft. Für die In-Ovo-Kultivierung wurden die Eier bei 37 °C und hoher Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Inkubationsstunden folgen dem Hamburger-Hamilton (HH)-Stadium (d. h. 26–29 Stunden Inkubation zur Gewinnung des HH-4-Embryos)52. Alle in dieser Studie durchgeführten Experimente entsprachen den relevanten Richtlinien und Vorschriften und die Versuchsprotokolle wurden vom Biosicherheitsbüro der University of Maryland genehmigt. In dieser Studie wurden keine lebenden Wirbeltiere verwendet.

Das Ex-Ovo-Kulturprotokoll wurde von Chapman et al. abgeleitet. und Schmitz et al.53,54 mit Modifikationen zur Anpassung an das Brillouin-Mikroskop. Für die Ex-ovo-Kultur wurde eine 35-mm-Glasbodenschale mit einer 20-mm-Mikrovertiefung (Cellvis, D35-20-0-N) verwendet. Ein 1-Zoll-Metallring (Thorlabs, SM1RR) wurde mit einem einschichtigen Parafilm bedeckt und ein 1 cm großes Ellipsenloch in die Mitte geschnitten und über der Mikrovertiefung (innere Bodenvertiefung der Schale) platziert. Um eine Ex-Ovo-Kultur durchzuführen, verwendeten wir die Filterpapierträgermethode, um das Blastoderm und die Vitellinmembran unter Spannung zu halten, um die Situation einer In-Ovo-Kultivierung nachzuahmen. Der vorkultivierte Embryo um HH 4 wurde aus dem Ei entnommen und dann mit der Rückenseite nach unten auf eine Kulturschale gelegt, die mit dünnem, aus dem Ei geerntetem Albumin (Kulturmedium) gefüllt war. Als nächstes wurde die Schale zur kontinuierlichen Kultivierung in einen Inkubator auf der Bühne (Warner Instruments, SA-20PLIXR-AL) gestellt. Um sicherzustellen, dass die Umgebungstemperatur des Embryos etwa 37 °C beträgt, wurde die Heizung (Warner Instruments, TC-344C) des eingeschalteten Inkubators unter Berücksichtigung der Wärmeableitung von der Unterseite des Tisches auf 39 ± 0,2 °C eingestellt offen zur Objektivlinse.

Unter spontaner Brillouin-Lichtstreuung versteht man die Wechselwirkungen zwischen dem einfallenden Licht und den inhärenten akustischen Phononen innerhalb einer Probe. Das Ergebnis dieser Wechselwirkung führt zu einer Frequenzverschiebung (Brillouin-Verschiebung) im ausgehenden Streulicht. Die Brillouin-Verschiebung \({\omega }_{B}\) ist definiert als \({\omega }_{B}=2n/\lambda \cdot \sqrt{{M}^{^{\prime}}/ \rho }\cdot \mathrm{sin}(\theta /2)\), wobei \(n\) der Brechungsindex des Materials ist, \(\lambda\) die Laserwellenlänge ist, \({M}^{ ^{\prime}}\) ist der Längsmodul, der die mechanischen Eigenschaften quantifiziert, \(\rho\) ist die Dichte und θ ist der Sammelwinkel des Streulichts. In unserem Brillouin-Mikroskop wurde rückwärts gestreutes Licht gesammelt, was \(\theta =180^\circ\) ergab.

Für biologische Materialien wurde eine empirische Beziehung zwischen dem Elastizitätsmodul \(E\) und dem von Brillouin abgeleiteten Längsmodul \({M}^{^{\prime}}\) festgestellt: \(\mathrm{log}\left( {M}^{^{\prime}}\right)=a\cdot \mathrm{log}\left(E\right)+b\), wobei die Parameter \(a\) und \(b\) sind materialabhängig24. Betrachtet man die Beziehung zwischen \({M}^{^{\prime}}\) und der Brillouin-Verschiebung \({\omega }_{B}\), hängt die relative Änderung der Brillouin-Verschiebung mit der des Youngschen Moduls um \ zusammen. (\Updelta E/E=2/a\cdot \Updelta {\omega }_{B}/{\omega }_{B}\). Für Zellen zeigt die Kalibrierung gegen AFM \(a=0,0671\). Hier haben wir diese kalibrierte Beziehung verwendet, um die relative Änderung des Young-Moduls abzuschätzen.

Für alle Experimente wurde ein konfokales Brillouin-Mikroskop verwendet. Einzelheiten zur Instrumentierung finden Sie in unserem aktuellen Bericht25. Kurz gesagt wurde als Lichtquelle ein Single-Mode-660-nm-Dauerstrichlaser mit einer Leistung von ~ 30 mW verwendet. Der Laserstrahl wurde durch eine auf einem Umkehrmikroskop (Olympus, IX81) installierte Objektivlinse (Olympus, 40 × /0,6 NA) in die Probe fokussiert, was eine Punktgröße von 0,7 μm × 0,7 μm × 2,6 μm ergibt. Das rückwärts gestreute Brillouin-Signal wurde mit demselben Objektiv gesammelt und mit einem zweistufigen VIPA-basierten Spektrometer (Light Machinery, 15 GHz FSR) analysiert. Das Brillouin-Spektrum wurde mit einer EMCCD-Kamera (Andor, iXon 897) mit einer Belichtungszeit aufgezeichnet von 0,05 s. 2D-Brillouin-Bilder wurden durch Scannen der Probe mit einem motorisierten Tisch (Schrittgröße: 0,5 µm) aufgenommen. Der Querschnitt senkrecht zur anterior-posterioren Körperachse wurde mit dem Brillouin-Mikroskop kartiert und die gemittelte Brillouin-Verschiebung der Neuralplattenregion wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften des Gewebes darzustellen. Der einzige Kontrast eines Brillouin-Bildes ergibt sich aus der unterschiedlichen Brillouin-Pixelverschiebung. Die Brillouin-Verschiebung des dünnen Albumin-Kulturmediums kommt der der Neuralplatte bei Embryonen im Frühstadium sehr nahe, was es schwierig macht, die Grenze des Neuralplattengewebes im Brillouin-Bild zu erkennen. Um dieses Problem zu lösen, wurde der Embryo unmittelbar vor der Aufnahme jedes Brillouin-Bildes vorübergehend auf eine andere Kulturschale übertragen, die mit Ringer-Lösung (Thermo Scientific, BR0052G) gefüllt war, die eine viel geringere Brillouin-Verschiebung aufweist und somit einen guten Kontrast bietet. Sobald die Brillouin-Messung abgeschlossen war, wurde der Embryo zur kontinuierlichen Entwicklung zurück auf dünnes Albumin-Kulturmedium übertragen. Zur Aufnahme der Hellfeldbilder wurden ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (Olympus, 4x/0,1) und eine CMOS-Kamera (Andor Neo) verwendet, als sich der Embryo in der Ex-Ovo-Kulturschale befand.

Zur Erfassung sowohl von Hellfeldbildern als auch der Brillouin-Spektren wurde ein selbst entwickeltes LabView-Erfassungsprogramm (National Instruments, Version 2021) verwendet. Zur Kalibrierung des Spektrometers wurden Brillouin-Spektren von Materialien (Wasser und Methanol) mit bekannten Brillouin-Verschiebungen aufgezeichnet und zur Berechnung des freien Spektralbereichs und des Pixel-zu-Frequenz-Konventionsverhältnisses verwendet. Die Brillouin-Verschiebung jedes Pixels wurde durch Anpassen des Brillouin-Spektrums an eine Lorentz-Funktion mit MATLAB (MathWorks, R2021b) ermittelt. 2D-Brillouin-Bilder wurden aus dem Pixelvektor rekonstruiert. Die Probengröße wurde auf der Grundlage früherer Erfahrungen ausgewählt und sollte angemessen groß sein, um die Durchführbarkeit der Technik zu demonstrieren.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar.

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Jitao Zhang

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JZ hat das Projekt konzipiert. CH, JZ und GS erstellten den Forschungsplan. CH führte die Experimente durch. Alle Autoren diskutierten die Daten. JZ und CH haben das Manuskript mit Beiträgen aller anderen Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Jitao Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Handler, C., Scarcelli, G. & Zhang, J. Mechanische Zeitraffer-Bildgebung des Neuralrohrverschlusses in lebenden Embryonen mittels Brillouin-Mikroskopie. Sci Rep 13, 263 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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Eingegangen: 13. Oktober 2022

Angenommen: 02. Januar 2023

Veröffentlicht: 06. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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