Auswirkungen von 5G - Changchun ClearFrontier Technologies Group Co., Ltd

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8305 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die potenziellen Gesundheitsrisiken der Exposition gegenüber hochfrequenten elektromagnetischen Feldern mobiler Kommunikationstechnologien haben gesellschaftliche Bedenken hervorgerufen. Es wurden Richtlinien zum Schutz der Bevölkerung festgelegt (z. B. unspezifische Erwärmung über 1 °C bei Exposition gegenüber Hochfrequenzfeldern), es bleiben jedoch Fragen zu den möglichen biologischen Auswirkungen nichtthermischer Expositionen bestehen. Mit dem Aufkommen der fünften Generation (5G) der Mobilkommunikation ist die Beurteilung, ob die Exposition gegenüber diesem neuen Signal eine zelluläre Stressreaktion auslöst, einer der obligatorischen Schritte auf der Roadmap für einen sicheren Einsatz und die Bewertung von Gesundheitsrisiken. Mithilfe der BRET-Technik (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) haben wir beurteilt, ob lebende menschliche Keratinozyten und Fibroblastenzellen kontinuierlich oder intermittierend (5 Min. EIN/10 Min. AUS) 5G-3,5-GHz-Signalen mit einer spezifischen Absorptionsrate (SAR) von bis zu 4 ausgesetzt sind W/kg über 24 Stunden beeinflusst die basale oder chemisch induzierte Aktivität des Hitzeschockfaktors (HSF), des RAt-Sarkomvirus (RAS) und der Kinasen der extrazellulären signalregulierten Kinasen (ERK) sowie des promyelozytischen Leukämieproteins (PML), die alle molekular sind Signalwege, die an Reaktionen auf Zellstress in der Umwelt beteiligt sind. Die Hauptergebnisse sind (i), eine Abnahme des basalen HSF1-BRET-Signals, wenn Fibroblastenzellen den niedrigeren getesteten SARs (0,25 und 1 W/kg), jedoch nicht dem höchsten (4 W/kg) ausgesetzt wurden, und ( ii) eine leichte Abnahme der maximalen Wirksamkeit von As2O3 zur Auslösung der PML-SUMOylierung, wenn Fibroblastenzellen, aber keine Keratinozyten, kontinuierlich dem 5G-RF-EMF-Signal ausgesetzt wurden. Angesichts der Inkonsistenz dieser Effekte in Bezug auf den betroffenen Zelltyp, den effektiven SAR-Wert, den Expositionsmodus und die molekulare Stressreaktion der Zellen kamen wir jedoch zu dem Schluss, dass unsere Studie keine schlüssigen Beweise dafür liefert, dass molekulare Effekte auftreten können, wenn Hautzellen der 5G-HF-Strahlung ausgesetzt werden -EMF allein oder mit einem chemischen Stressor.

Im Zuge der rasanten Entwicklung der mobilen Telekommunikation in den letzten Jahrzehnten wurde die 5. Generation (5G) drahtloser Netzwerke entwickelt, um die 4G-LTE-Technologie zu verbessern, indem Probleme im Zusammenhang mit dem exponentiellen Nutzungsanstieg, der Anzahl verbundener Geräte und dem Bedarf gelöst werden höhere Zuverlässigkeit und geringere Latenz1,2. Solche Erfolge erforderten neue Frequenzbänder zusätzlich zu den bereits für 2G, 3G und 4G bereitgestellten. Unter ihnen bietet das 3,4- bis 3,8-GHz-Band einen guten Kompromiss zwischen Breitbandabdeckung und Geschwindigkeit, während das 26-GHz-Band, das sich durch eine schlechte Ausbreitung und Durchdringung innerhalb von Gebäuden auszeichnet, in einer zweiten Stufe bereitgestellt wird, um begrenzte Bereiche mit hoher Datenmenge abzudecken Verkehr. Daher ist das 3,5-GHz-Band (auch C-Band genannt), das die gleichen Mobilfunkstandorte wie die aktuellen 2,6-GHz- und 1,8-GHz-Mobilfunkantennen nutzen kann, das Kernband des aktuellen 5G.

Die biologischen und gesundheitlichen Auswirkungen der Exposition gegenüber hochfrequenten elektromagnetischen Feldern (RF-EMF) in der Umwelt sind seit dem späten 20. Jahrhundert Gegenstand zahlreicher Studien und stehen immer noch im Mittelpunkt gesellschaftlicher Bedenken. Dieses Forschungsgebiet wurde auch durch die Entscheidung der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) im Mai 2011 gestärkt, hochfrequente elektromagnetische Felder als 2B-Karzinogene einzustufen.

Obwohl die Energie von HF-Photonen nicht stark genug ist, um chemische Veränderungen in biologischen Zielen, wie etwa DNA-Brüche, auszulösen, ist die dielektrische Erwärmung lebenden Gewebes unter HF-EMF-Einwirkung vollständig charakterisiert. Daher wurden Leitlinien zum Schutz der Bevölkerung vor den damit verbundenen Risiken3 erstellt. Ob eine HF-EMF-Exposition jedoch „nichtthermische“ Effekte (dh biologische Effekte, die nicht durch einen Temperaturanstieg in lebendem Gewebe verursacht werden) auslösen kann, bleibt eine schwierig zu untersuchende Frage. Da es keine mechanistische Unterstützung für diese Effekte gibt, kann sich die wissenschaftliche Gemeinschaft nur auf empirische Untersuchungen zu möglichen nichtthermischen HF-EMF-Effekten verlassen4,5,6.

Leider liegen nur sehr wenige Daten aus wissenschaftlichen Studien über die potenzielle biologische Gefahr vor, die durch die Exposition gegenüber hochfrequenten elektromagnetischen Feldern gegenüber den neuen Frequenzsignalen, die in 5G verwendet werden, entsteht. Nach unserem besten Wissen wurden bereits sechs Artikel von vier verschiedenen Teams veröffentlicht, in denen die Auswirkungen unmodulierter oder GSM-modulierter 3,5-GHz-HF-EMF auf lebende Materie untersucht wurden. Seitdem wurden jedoch keine biologischen Studien mit 5G veröffentlicht -modulierte 3,5 GHz RF-EMF-Signale. Dasgupta et al. setzten sich entwickelnde Zebrafische 6 bis 48 Stunden nach der Befruchtung unter isothermen Kulturbedingungen unmoduliertem 3,5-GHz-HF-EMF mit einer spezifischen Absorptionsrate (SAR) von 8,27 W/kg aus7,8. Diese Autoren maßen subtile, aber anhaltende sensomotorische Effekte und eine geringfügige transkriptomische Störung 48 Stunden nach der Befruchtung mit 28 unterschiedlich exprimierten Genen in den exponierten Gruppen. Ob diese Effekte mit richtlinienkonformen SAR-Werten noch messbar sind, muss noch ermittelt werden. Wang et al. bewerteten die Auswirkungen kurz- und langfristiger Expositionen mit unmoduliertem 3,5-GHz-HF-EMF bei drei verschiedenen SAR (2,6, 26 und 260 mW/kg) auf Drosophila melanogaster9,10. Diese Autoren zeigten einen moderaten, aber signifikanten Einfluss auf die Insektenaktivität, den Schlaf und die Entwicklung, der mit einer Veränderung der Expression von Genen einherging, die an zirkadianen Rhythmen, thermischem Stress, oxidativem Stress und humoraler Immunität beteiligt sind. Yang et al. untersuchten die Wirkung einer unmodulierten 3,5-GHz-HF-EMF-Exposition mit einem SAR von 0, 2, 4 oder 10 W/kg über 72 Stunden auf angstähnliches Verhalten und den auditorischen Kortex (ACx) bei Meerschweinchen. Diese Studie wies auf einen SAR-abhängigen Anstieg von oxidativem Stress, Apoptose-Induktion und ultrastruktureller Schädigung bei ACx hin, ohne dass die Angst- und Hörschwellen der Tiere anstiegen11. Schließlich haben Bektas et al. untersuchten, ob das GSM-modulierte 3,5-GHz-Signal eine Veränderung der Energiehomöostase und des Redoxgleichgewichts im Gehirn von diabetischen und gesunden Ratten hervorrief, die 30 Tage lang 2 Stunden am Tag einem berechneten SAR von 0,323 W/kg im Gehirn ausgesetzt waren12. Nach HF-EMF-Exposition wurden bei diabetischen und gesunden Ratten verringerte Gesamtantioxidantienspiegel und erhöhte Gesamtoxidantien- und H2O2-Spiegel im Gehirngewebe beobachtet. Diese Autoren beobachteten auch, dass RF-EMF die Schwankung der Hormonspiegel verursachte, die die Nahrungsaufnahme und den Energiestoffwechsel im Gehirn beeinflussen, und die Anzahl degenerierter Neuronen im Hippocampus erhöhte. Insgesamt deuten diese Studien auf eine mögliche Wirkung von 3,5 GHz HF-EMF auf mehrere Stressreaktionswege in Eukaryoten-Organismen hin.

Die Beurteilung, ob neue RF-EMF-Technologien unter gut kontrollierten Expositionsbedingungen eine zelluläre Stressreaktion auslösen, ist daher einer der obligatorischen Schritte auf der Roadmap für die Bewertung des Gesundheitsrisikos von 5G-Signalen. Insbesondere auf molekularer Ebene wurde stark diskutiert, ob die Expression von Hitzeschockproteinen (HSP) und RAS/MAPK-Signaltransduktionswegen induziert werden, da diese molekularen Systeme eine zentrale Rolle bei den Stressreaktionen von Zellen spielen13,14. Es bleiben auch Fragen hinsichtlich des Auftretens von oxidativem Stress in Zellen, die HF-EMF ausgesetzt sind15. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Auswirkungen neu eingesetzter HF-Signale wie des 5G-Signals auf generische molekulare Mechanismen, die an der zellulären Stressreaktion beteiligt sind, weiter zu untersuchen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung eines 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signals auf den basalen und chemisch induzierten Hitzeschockfaktor 1 (HSF1), das RAt-Sarkomvirus (RAS) und die extrazellulären signalregulierten Kinasen (ERK). Kinasen und promyelozytische Leukämie (PML)-Aktivitäten.

HSF1 ist der „Hauptregulator“ der Transkription von Hitzeschockproteinen in Eukaryoten16. RAS- und ERK-Kinasen sind Schlüsselelemente der Ser/Thr-Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Kaskaden (MAPK), die nach der Aktivierung von RAS17,18 extrazelluläre Signale an intrazelluläre Prozesse weiterleiten. Der RAS/MAPK-Signalweg ist von zentraler Bedeutung für die Regulierung verschiedener zellulärer Prozesse wie Genexpression, Zellwachstum und Überleben. Schließlich ist das PML-Protein der Grundstein für die Bildung von PML-Kernkörpern (PML NBs). Dabei handelt es sich um kugelförmige Kerndomänen, die sich als Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen, einschließlich oxidativem Stress, bilden und die für Apoptose, Seneszenz, DNA-Reparatur, epigenetische Kontrolle sowie die Kontrolle der Onkogenese von größter Bedeutung sind19. Die Bildung von PML-NBs ist daher ein Marker für zelluläre Stressreaktionen und auch wichtig für die Aktivität zahlreicher Transkriptionsfaktoren und Kernproteine, einschließlich HSF1 und ERK20,21,22,23,24. In unserer Studie wurden menschliche Hautfibroblasten und Keratinozyten als Zellmodelle verwendet, da Hautzellen das primäre Zielgewebe der 5G-Exposition sein werden, das bei der Risikobewertung berücksichtigt werden muss25. Diese Zellen wurden kontinuierlich oder intermittierend (5 Min. EIN/10 Min. AUS) dem 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signal bei 0,25, 1 und 4 W/kg unter isothermen Bedingungen für 24 Stunden ausgesetzt, bevor HSF1, RAS, ERK, und PML-Aktivitäten wurden dank bewährter molekularer Sonden auf der Basis von Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET) bewertet13,14,26.

RAS- und ERK-BRET-Sensoren wurden entwickelt, indem der fluoreszierende Energiedonor (ECFP oder Türkis-GL) und der fluoreszierende Energieakzeptor (YPet-M) der FRET-Sonden EKAREV und RaichuEV-ras27 durch nanoLuciferase (nLuc28) und mNeonGreen (mNeonG29) ersetzt wurden. jeweils. Die Expressionsvektoren für Säugetiere, die FRET-Sonden für ERK (pEKAREV) und RAS (pRaichuEV-Ras) kodieren, wurden freundlicherweise von Dr. Matsuda M (Universität Kyoto, Japan) zur Verfügung gestellt. Die für nLuc und mNeonG kodierende cDNA wurde zunächst synthetisiert (Genescript, Rijswijk, Niederlande) und dann anstelle des fluoreszierenden Energiedonors zwischen NotI und XbaI in pKAREV- und pRaichuEV-Ras-Expressionsvektoren kloniert.

Die cDNA, die für die Proteine nLuc-HSF1 und mNeonG-HSF1 kodiert, wurde von den Expressionsvektoren rLuc-HSF1 und sYFP2-HSF113 abgeleitet, in denen die Renilla-Luciferase-II- und sYFP2-Gruppen zwischen BamHI und EcoRI durch nLuc bzw. mNeonG ersetzt wurden. Der HSP90-Expressionsvektor wurde auch von Poque et al.13 beschrieben.

In ähnlicher Weise wurde die cDNA, die für die Proteine nLuc-PMLIII und mNeonG-SUMO1 kodiert, von den Expressionsvektoren rLuc-PMLIII und YFP-SUMO1 abgeleitet, in denen Renilla Luciferase und YFP zwischen BamHI und EcoRI durch nLuc bzw. mNeonG ersetzt wurden.

As2O3 (A1010, 330 mM Stammlösung, resuspendiert in 1 N NaOH) und MG132 (C2211, Z-Leu-Leu-Leu-al, 50 mM Stammlösung, resuspendiert in DMSO) stammten von Sigma (Lyon, Frankreich). Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) wurde von Tocris (Bristol, UK) und Coelenterazin H von Nanolight Technology (Pinetop, AZ, USA) erworben.

Wir haben die immortalisierte Hautfibroblastenlinie SV-40 einer 19-jährigen Frau mit Xeroderma pigmentosum (XP), Komplementationsgruppe D, und die XP6BE-Linie30 des Coriell Institute (Camden, NJ) verwendet. XP6BE-Fibroblasten wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (DMEM) (D6429, Sigma), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten ml-1 Penicillin und Streptomycin, gehalten. HaCaT-Keratinozyten31 wurden in Keratinozyten-SFM (Ref. 17005-034; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gehalten, ergänzt mit Bovine Hypophyse Extract (BPE; Katalognummer 13028-014, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). & Humaner rekombinanter EGF (Katalognummer 10450-13, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), geliefert mit dem Kit Gibco™ Keratinozyten-SFM-Ergänzung (Ref. 37000015, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 24 Stunden vor der Transfektion wurden die Zellen mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro Vertiefung in Schalen mit 6 Vertiefungen ausgesät. Vorübergehende Transfektionen wurden unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI, linear, MW 25.000; Katalognummer 23966 Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) mit einem PEI:DNA-Verhältnis von 4:1 durchgeführt, wie zuvor beschrieben32. Zur Messung der HSF1-Aktivität wurden 0,1 µg nLuc-HSF1-Expressionsvektor mit 1,4 µg mNeonG-HSF1 und 0,5 µg HSP90-Expressionsvektoren co-transfiziert. Zur Messung der RAS- und ERK-Aktivitäten wurden 1 µg pEKAREV- oder pRaichuEV-Ras BRET-Expressionsvektoren mit 1 µg leerem Vektor co-transfiziert. Zur Messung der PML-Aktivität wurden 0,1 µg nLuc-PMLIII-Expressionsvektor mit 1,9 µg mNeonG-SUMO1 co-transfiziert. Nach der Inkubation über Nacht wurden die transfizierten Zellen dann abgelöst, in DMEM ohne rotes Phenol (Ref. 21063-029, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) resuspendiert und mit einer Dichte von 10 Zellen pro Vertiefung in weißen Platten mit 96 Vertiefungen erneut ausplattiert Klare Böden (Greiner Bio One, Courtaboeuf, Frankreich), vorbehandelt mit D-Polylysin (Sigma, Lyon, Frankreich) zum Ablesen mit dem Tristar2-Luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) oder auf Glasdeckgläsern mit 12 mm Durchmesser (Knittel Glass). , Braunschweig, Deutschland) behandelt mit d-Polylysin für die Messung mit dem Spektrometer SpectraPro 2300i (Acton Optics, Acton, MA, USA) (siehe unten). Die Zellen wurden 24 Stunden lang in Kultur belassen, bevor sie für den BRET-Assay verarbeitet wurden.

Die Zellen wurden 24 Stunden lang einer Schein-Exposition unterzogen (dh die Zellen wurden in Abwesenheit von RF-EMF kultiviert) oder 24 Stunden lang den angegebenen RF-EMF-Expositionsbedingungen ausgesetzt. Während der letzten 18 Stunden, 4 Stunden oder 15 Minuten der Schein- oder HF-Exposition wurden die Zellen mit der angegebenen Konzentration von MG132, As2O3 bzw. PMA inkubiert (Abb. 1A). In jeder 96-Well-Platte wurde nur eine Chemikalie getestet; Allerdings wurden verschiedene Konzentrationen derselben chemischen Verbindung gleichzeitig in einer einzigen Platte getestet, indem 10-fache Stammlösungen, die auf 37 °C vorgewärmt waren, mit einer Mehrkanalpipette injiziert wurden. Wenn angezeigt, wurde eine Scheinbehandlung durchgeführt, indem nur das Solvatisierungsmittel in das Zellkulturmedium (DMSO für MG132 und PMA oder Wasser für As2O3) injiziert wurde. Zur Durchführung der chemischen Behandlung wurden die Platten aus der Nachhallkammer entfernt (siehe unten „Zellen“) Belichtung, Belichtungsaufbau und Dosimetrie“ im Abschnitt „Material und Methoden“) und sofort an eine Thermostat Plus-Mikroplatten-Peltier-Heizung (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) angedockt, um die Zellen auf 37 °C zu halten. Die scheinbelichteten Platten wurden auf die gleiche Weise behandelt. Das Entfernen der Platte aus der Nachhallkammer, das Einbringen der Chemikalien in den verschiedenen Konzentrationen in das Zellkulturmedium mithilfe einer Mehrkanalpipette und das Zurücksetzen der Zellen in die Nachhallkammer dauerte weniger als 1 Minute. Nach Abschluss der verbleibenden HF-Exposition wurden 5 µM Coelenterazin H zum Zellkulturmedium gegeben und das BRET-Signal sofort mit einem auf 37 °C vorgeheizten und ausgestatteten Mikroplattenlesegerät TriStar2 LB942 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) erfasst mit Emissionsfiltern zentriert bei 515 ± 20 nm für mNeonG (Iacceptor) und 460 ± 20 nm für nLuc (Idonor). Alternativ wurden für die Echtzeit-BRET-Messung unter RF-EMF-Exposition 5 µM Coelenterazin H 10 Minuten vor dem Ende der RF-EMF-Exposition zum Zellkulturmedium gegeben und die vollständigen BRET-Spektren wurden in den letzten 5 Minuten aus der Ferne aufgezeichnet HF-EMF-Exposition und die nächsten 5 Minuten ohne HF-EMF. Vollständige BRET-Spektren wurden unter Verwendung einer optischen Faser erfasst, die mit einem IsoPlane SCT-320 Imaging Spectrograph verbunden war, der mit einer rückseitig beleuchteten CCD-Kamerasystemkamera BLAZE:400B zur Aufzeichnung des gesamten sichtbaren Spektrums ausgestattet war (Teledyne France – Princeton Instruments, Lisses, Frankreich).

(A) Zeitleiste der RF-EMF-Exposition und der Zugabe chemischer Medikamente zum Zellkulturmedium. RF-EMF (oder Schein-RF-Exposition) wird 24 Stunden lang angewendet, unabhängig davon, welches Medikament für den angegebenen Zeitraum injiziert wird. (B,C) Temperaturschwankung in Platten, die einem kontinuierlichen (B) oder intermittierenden (C) 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signal mit 4 W/kg ausgesetzt sind. Die Temperatur im Inkubator wurde so eingestellt, dass eine zelluläre Exposition bei 37 °C gewährleistet ist und der durch HF-EMF verursachte Temperaturanstieg zu Beginn der Expositionsperiode kompensiert wird. Die Medikamenteninjektion führt zu einem vorübergehenden Abfall der Zellkulturtemperatur um weniger als 0,5 °C (B).

Das BRET-Signal wurde durch Berechnung des Verhältnisses der im Akzeptorfenster (ImNeonG) gemessenen Emissionsintensität zur im Donorfenster (InLuc) gemessenen Emissionsintensität gemäß Gleichung (1) bestimmt. (1)

Aufgrund der überlappenden Emissionsspektren von nLuc und mNeonG stammt ein Teil des im mNeonG-Filter erfassten Lichts aus der Luciferase-Emission, was zu einem kontaminierenden Signal führt33. In dieser Konfiguration wurde der Netto-BRET daher als BRET-Verhältnis von Zellen definiert, die nLuc- und mNeonG-Konstrukte gleichzeitig exprimieren, abzüglich des BRET-Verhältnisses von Zellen, die im selben Experiment nur das nLuc-Konstrukt exprimieren.

Die Software GraphPad Prism v8.00 für Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) wurde zum Zeichnen von Dosis-Wirkungs-Kurven und zur Durchführung statistischer Analysen verwendet. Die Größe der Fehlerbalken gibt die SD innerhalb des Datensatzes an. Sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurven wurden unter Verwendung von Gl. angepasst. (2):

wobei X der Logarithmus der Agonistenkonzentration und Y die Reaktion ist; Unten ist der Y-Wert auf dem unteren Plateau dargestellt und wird als Maß für den Grundgrad der Aktivierung der verschiedenen Sonden verwendet. Oben ist der Y-Wert auf dem oberen Plateau und Oben–Unten wird als Maß für die maximale Wirksamkeit einer bestimmten chemischen Behandlung bei jeder BRET-Sonde verwendet. Log EC50 ist der X-Wert, wenn die Reaktion in der Mitte zwischen Bottom und Top liegt (Supp. Abb. 1). Der EC50-Wert stellt daher ein Maß für die scheinbare Wirksamkeit der verschiedenen chemischen Verbindungen dar, die Aktivierung ihrer zugehörigen BRET-Sonde auszulösen (Supp. Abb. 1). Die Wirksamkeit der Chemikalien zur Aktivierung oder Hemmung der verschiedenen Sonden wird als pEC50 ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) ausgedrückt, was –log EC50 entspricht.

Der Wilcoxon-Signed-Rank-Test mit einer Stichprobe wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der in jedem unabhängigen Experiment berechneten Unterschiede zwischen Schein- (keine RF-EMF-Bedingung) und RF-EMF-Expositionsbedingungen für basales BRET, die Wirksamkeit und Wirksamkeit von Chemikalien anhand der Nullhypothese zu bewerten (im Folgenden als ΔBasal BRET, ΔpEC50 bzw. ΔMax Wirksamkeit bezeichnet). Die Gesamtzahl der unabhängigen Experimente (n), die für jede Versuchsbedingung durchgeführt wurden, ist angegeben. Für jede RF-EMF-Expositionsbedingung wurde eine Schein-Exposition durchgeführt. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Die Zellen wurden 24 Stunden lang in 96-Well-Gewebekulturplatten (TCP) bei SAR-Werten von 0,25, 1 und 4 W/kg exponiert. Eine intermittierende Exposition (5 Minuten EIN/10 Minuten AUS) bei demselben durchschnittlichen SAR-Wert wie im Dauerstrichmodus (CW) wurde implementiert, um die tatsächliche Exposition im wirklichen Leben nachzuahmen und dabei zu helfen, potenzielle nichtthermische Bioeffekte zu erkennen. Unter identischen Versuchsbedingungen wurden auch HF-EMF-Scheinexpositionen durchgeführt, jedoch mit ausgeschaltetem Generator, dh bei einem SAR-Wert von 0 W/kg. Ein neuartiges, kürzlich entwickeltes und charakterisiertes Expositionssystem wurde zum ersten Mal für die Exposition von Zellen gegenüber 5G-modulierten 3,5-GHz-Signalen verwendet34. Das System basierte auf einem Zellkultur-Inkubator, der die Aufrechterhaltung der gewünschten biologischen Bedingungen von 37 °C und 5 % CO2 ermöglichte. Eine umfassende Charakterisierung des Systems durch experimentelle Messungen und numerische Simulationen wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben34. Kurz gesagt wurde ein 150-l-Inkubator (BINDER GmbH, Tullingen, Deutschland) aus Edelstahlwänden als Nachhallkammer verwendet, d. h. ein metallischer großer, geschlossener Hohlraum mit einem hohen Q-Faktor, in dem eine statistisch homogene, Zufällig polarisierte und isotrope Feldverteilung wurde durch mechanisches Rühren der Feldkomponenten erreicht35. Über eine gedruckte Patchantenne wurde ein elektromagnetisches Signal mit 3,5 GHz an die biologischen Proben abgegeben. Ein Kunststoffhalter mit fünf Ebenen wurde verwendet, um zehn TCPs mit 6 oder 96 Vertiefungen aufzunehmen und gleichzeitig freizulegen, dh zwei pro Halterebene. Jede Vertiefung der TCPs mit 6 und 96 Vertiefungen wurde mit 2 ml bzw. 200 µl Zellkulturmedium gefüllt. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit während der Exposition sicherzustellen, wurde der Inkubator aufgrund der hohen SAR-Abhängigkeit von der Kammerlast mit der gleichen Konfiguration beladen, die auch für die elektromagnetische Charakterisierung verwendet wurde, d. h. mit vier bzw. sechs 6- bzw. 96-Well-TCPs.

Die Signalerzeugungseinheit besteht aus einem HF-Signalgenerator (SMBV100A, Rohde & Schwarz, München, Deutschland), einem Verstärker mit 45 dB Verstärkung (Mini-Circuits, ZHL-16W-43 +, NY, USA), einem Leistungszirkulator ( Pasternack, PE83CR1005, CA, USA) und ein bidirektionaler Koppler (Mini-Circuits, ZGBDC30-372HP +, NY, USA) befanden sich außerhalb des Inkubators. Um die kontinuierliche Überwachung der gewünschten Eingangsleistung in die Kammer sicherzustellen, wurden außerdem einfallende und reflektierte Leistungen mit einem Leistungsmesser (Agilent N1912A, USA) überwacht, der an den bidirektionalen Koppler angeschlossen war.

Der lokale SAR-Wert wurde experimentell durch Temperaturmessungen der durch HF-EMF induzierten Erwärmung ermittelt, die mit einer faseroptischen Sonde (Luxtron One, Lumasense Technologies, CA, USA) aufgezeichnet wurden. Der gemessene SAR-Wert im 96-Well-TCP betrug etwa 1 W/kg pro Watt Antenneneingangsleistung. Um unsere Systeme zu validieren, wurden numerische Simulationen unter Verwendung der auf der Finite-Differenz-Zeitdomäne (FDTD) basierenden elektromagnetischen Methodik36 durchgeführt. Die Ergebnisse der Simulationen wurden über 50 Positionen des Rührers gemittelt, was einer vollständigen Drehung entspricht. Obwohl numerische Simulationen möglicherweise nicht das Fehlen von Hotspots an bestimmten Stellen der freiliegenden Bohrlöcher garantieren, stellte das kontinuierliche Rühren der Feldkomponenten durch die mechanische Drehung des Metallrührers das Erreichen einer guten SAR-Homogenität mit einer Variation innerhalb von 30 % sicher. Insgesamt haben wir gezeigt, dass experimentelle und numerische SARs mit Unterschieden < 30 % unter Berücksichtigung der Standardabweichung, die den ICNIRP-Richtlinien entspricht3, gut übereinstimmen. Basierend auf gemessenen und simulierten Werten, die auf 1 W normiert wurden, wurde die einfallende Leistung während der biologischen Exposition angepasst, um die erforderlichen Expositionswerte von 0,25, 1 und 4 W/kg in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen zu erreichen. Messungen des induzierten Temperaturanstiegs des exponierten Mediums wurden auch mit der Luxtron-Sonde (Lumasense) unter den spezifischen zellulären Expositionsbedingungen der Studie durchgeführt und zeigten einen Temperaturanstieg von 1,7 °C bei 4 W/kg, 0,7 °C bei 1 W /kg und ein vernachlässigbarer Temperaturanstieg unter 0,1 °C bei 0,25 W/kg bei kontinuierlicher HF-Exposition und ein Temperaturanstieg von 0,8 °C bei 4 W/kg, 0,3 °C bei 1 W/kg und weniger als 0,1 °C bei 0,25 W/kg unter Verwendung einer intermittierenden (5 Min. EIN, 10 Min. AUS) HF-Exposition. Die Temperatur des Inkubators wurde entsprechend gesenkt, um die biologischen Proben auf 37 °C zu halten. Die Temperaturstabilität der Zellkulturen am Boden der Kulturvertiefungen während der gesamten HF-Sitzung bei den verschiedenen SAR-Werten wurde sorgfältig in einem Satz separater Platten bewertet (siehe Abb. 1B, C für typische Temperaturkurven, die bei 4 W/kg unter kontinuierlicher Messung erhalten wurden). bzw. intermittierende Expositionsbedingungen). Wie erwartet schwankt die Temperatur der Zellkultur, die dem intermittierenden Signal ausgesetzt ist, leicht (Abb. 1C). Bemerkenswert ist, dass die Injektion der Chemikalie einen vorübergehenden Abfall der Zellkulturtemperatur um weniger als 0,5 °C auslöste, wie in Abb. 1B veranschaulicht.

Die Hypothese, dass 5G-modulierte 3,5-GHz-HF-EMF die basale oder chemisch induzierte Aktivität von HSF1, RAS, ERK oder PML beeinflussen kann, wurde mithilfe von BRET-basierten Tests getestet, die zuvor von unserem Team beschrieben wurden13,14,26. BRET ist ein zellbasierter Assay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinkonformationsänderungen in Echtzeit- und lebenden Zellen. Diese Technik beruht auf der Forster-Resonanzenergieübertragung von einem biolumineszierenden Donor auf einen fluoreszierenden Akzeptor, die beide mit den interessierenden Proteinen fusioniert sind. In unserem Versuchsdesign wurden BRET-Sonden in lebenden Zellen exprimiert. Da die in dieser Studie verwendeten Fibroblasten- und Keratinozyten-Zelllinien schwieriger zu transfizieren sind als die in unseren früheren Studien verwendeten HEK293T-Zellen, haben wir das rLuc2-Protein in unseren BRET-Assays systematisch durch die hellere NanoLuciferase (nLuc)28 ersetzt. Aufgrund der größeren Überlappung zwischen nLuc-Emissionsspektren und mNeonG-Anregungsspektren37 haben wir in allen unseren Tests auch den fluoreszierenden Akzeptor sYFP2 durch mNeonGreen (mNeonG) ersetzt.

Um die HSF1-Aktivität zu überwachen, haben wir zuvor einen intermolekularen BRET-Test entwickelt, der die Nachverfolgung der HSF1-Trimerisierung13 ermöglicht, einem Schlüsselereignis auf der Roadmap der HSF1-Aktivierung als Reaktion auf Stressbedingungen wie Hitzestress, oxidativer Stress oder proteotoxischer Stress38. In diesem Assay wird N-terminal nLuc-markiertes HSF1 zusammen mit mNeonG-markiertem HSF1 in einer bestimmten Zelllinie exprimiert. Da HSF1 bei der Aktivierung trimerisiert, erhöht sich das resultierende BRET-Signal nach der HSF1-Aktivierung, da durch die Trimerisierung Donor- und Akzeptorgruppen in unmittelbare Nähe gebracht werden13 (Abb. 2A).

Auswirkung einer kontinuierlichen oder intermittierenden 5G-Signalexposition auf die HSF1-Aktivierung in XP6BE-Fibroblasten. (A) Wirkungsweise des intermolekularen HSF1 BRET-Assays. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven von MG132-induzierten Veränderungen im nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 BRET-Signal. XP6BE-Fibroblastenzellen, die vorübergehend die Proteine nLuc-HSF1 und mNeonG-HSF1 koexprimieren, wurden vor der BRET-Messung 18 Stunden lang bei 37 °C mit zunehmender MG132-Konzentration aktiviert. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt ± SEM von 10 unabhängigen Experimenten dar, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Der pEC50 von MG132 betrug 6,83 ± 0,25, während die maximale Wirksamkeit von MG132 0,106 ± 0,018 betrug. (C–E) XP6BE-Hautfibroblasten, die mit der BRET-Sonde nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 transfiziert wurden, wurden entweder kontinuierlich oder intermittierend 24 Stunden lang schein-exponiert oder 5G-modulierten 3,5 GHz bei 0,25, 1 oder 4 W/kg ausgesetzt (5 min EIN/10 min AUS). Die Zellen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von MG132 unter Schein- oder RF-EMF-Exposition für die letzten 18 Stunden des RF-EMF-Expositionszeitraums aktiviert, bevor BRET-Messungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse in den Feldern CE stellen die Box- und Whisker-Diagramme der basalen BRET-Variation (C), der MG132-Potenzvariation (D) und der MG132-maximalen Wirksamkeitsvariation (E) zwischen den 5G RF-EMF-exponierten (Expo) und dar Scheinbedingungen sowohl im kontinuierlichen als auch im intermittierenden (ein/aus) Belichtungsmodus. Die statistische Signifikanz der Ableitung aus der Nullhypothese (kein Unterschied zwischen Schein- und HF-EMF-Exposition) wurde mithilfe des Wilcoxon Signed Rank-Tests mit einer Stichprobe bewertet. n = 6–12 je nach Versuchsbedingungen. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01.

Um die Funktionalität dieses Assays in Hautfibroblasten zu beurteilen, exprimierten wir nLuc-HSF1 mit mNeonG-HSF1 in der XP6BE-Fibroblastenzelllinie39 und forderten die transfizierten Zellen mit zunehmenden Konzentrationen des Proteasom-Inhibitors MG132 heraus, um einen proteotoxischen Stress auszulösen40. Wie erwartet induzierte MG132 einen konzentrationsabhängigen Anstieg des basalen BRET-Signals mit einem EC50-Wert im Hundert-Nanmol-Bereich (Abb. 2B), was die Wirksamkeit des Assays zeigt.

Anschließend untersuchten wir, ob eine kontinuierliche oder intermittierende (5 Min. EIN/10 Min. AUS) Zellexposition gegenüber einem 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signal bei 0,25, 1 und 4 W/kg unter isothermen Bedingungen über 24 Stunden Einfluss auf die nLuc-HSF1/ mNeonG-HSF1-Basal-BRET-Signal oder entweder die MG132-Potenz oder -Wirksamkeit zur Aktivierung von HSF1 in der transfizierten XP6BE-Fibroblastenzelllinie. Interessanterweise haben wir nur eine geringe, aber signifikante und reproduzierbare Abnahme des HSF1-Basal-BRET gemessen, wenn die XP6BE-Fibroblastenzelllinie 24 Stunden lang kontinuierlich mit 0,25 W/kg oder 24 Stunden lang intermittierend mit 0,25 und 1 W/kg exponiert wurde (Abb. 2C). . Während dieser Rückgang des BRET-Signals nur etwa 6 bis 10 % des gemessenen basalen BRET ausmacht, entspricht er proportional etwa 37 bis 61 % (in absoluten Zahlen) der durch MG132 ausgelösten Wirkung (Tabellen 1 und 2). Bei 4 W/kg wurde kein Effekt gemessen, unabhängig davon, ob das Signal kontinuierlich oder intermittierend ausgesendet wurde. Außerdem veränderte die Exposition gegenüber dem RF-EMF-Signal weder die Wirksamkeit von MG132 noch seine Wirksamkeit zur Aktivierung von HSF1, unabhängig von der SAR und dem kontinuierlichen oder intermittierenden Emissionsmodus des Signals (Abb. 2D, E, Tabellen 3 und 4).

Um den möglichen Einfluss von 5G-modulierten 3,5-GHz-HF-EMF-Expositionen auf die basale oder chemisch induzierte RAS-Aktivität zu bewerten, wurden XP6BE-Fibroblastenzellen mit einer BRET-Sonde transfiziert, die aus der Sandwich-Anordnung des H-Ras und der Ras-Bindungsdomäne von Raf besteht ( Raf RBD) zwischen nLuc und mNeonGreen. Diese molekulare BRET-Sonde ist von der Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Sonde (FRET) abgeleitet, die vom Matsuda-Labor27,41 beschrieben wurde, und beruht auf der Annäherung von nLuc und mNeonG nach der Bindung von GTP-Ras an Raf RBD (Abb. 3A).

Auswirkung einer kontinuierlichen oder intermittierenden 5G-HF-EMF-Exposition auf die RAS-Aktivierung in XP6BE-Hautfibroblasten. (A) Wirkungsweise des RAS BRET-Biosensors. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven der PMA-induzierten Änderung der RAS-Aktivität unter Verwendung der pRaichuEV-Ras BRET-Sonde. XP6BE-Fibroblasten wurden vor der BRET-Messung 15 Minuten lang bei 37 °C mit zunehmender PMA-Konzentration aktiviert. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt ± SEM von 10 unabhängigen Experimenten dar, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Der pEC50 von PMA betrug 7,60 ± 0,17, während die maximale Wirksamkeit von PMA 0,107 ± 0,012 betrug. (C–E) Mit der pRaichuEV-Ras BRET-Sonde transfizierte XP6BE-Fibroblastenzellen wurden 24 Stunden lang entweder kontinuierlich oder intermittierend (5 Minuten ON/ 10 Min. AUS). Die Zellen wurden unter Verwendung zunehmender PMA-Konzentrationen unter Schein- oder RF-EMF-Exposition für die letzten 15 m aktiviert, bevor BRET-Messungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse in den Feldern CE stellen die Box- und Whisker-Diagramme der basalen BRET-Variation (C), der PMA-Potenzvariation (D) und der PMA-maximalen Wirksamkeitsvariation (E) zwischen den 5G RF-EMF-exponierten (Expo) und dar Scheinbedingungen sowohl im kontinuierlichen als auch im intermittierenden Belichtungsmodus. Die statistische Signifikanz der Ableitung aus der Nullhypothese (kein Unterschied zwischen Schein- und HF-EMF-Exposition) wurde mithilfe des Wilcoxon Signed Rank-Tests mit einer Stichprobe bewertet. n = 6–12 je nach Versuchsbedingungen. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01.

In ähnlicher Weise wurde der mögliche Einfluss einer 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signalexposition auf die basale oder chemisch induzierte ERK-Aktivität in XP6BE-Fibroblastenzellen bewertet, die mit einer BRET-Sonde transfiziert wurden, die eine ERK-Sensordomäne und eine ERK-Ligandendomäne umfasst, die durch ein flexibles Kabel verbunden sind Linker, aber eingebettet zwischen einem mNeonG und nLuc anstelle von zwei fluoreszierenden Energieakzeptoren und -donoren, wie ursprünglich beschrieben27 (Abb. 4A). Nach der Aktivierung phosphorylieren endogene ERK-Proteine den Sensorteil dieser BRET-Sonde. Dadurch wird die Interaktion der Sensordomäne mit der Ligandendomäne ausgelöst, wodurch der Biosensor sich selbst schließt. Eine solche Konformationsänderung bringt nLuc in unmittelbare Nähe zu mNeonGreen und erhöht dadurch die BRET-Effizienz.

Einfluss einer kontinuierlichen oder intermittierenden 5G-HF-EMF-Exposition auf die ERK-Aktivierung in XP6BE-Hautfibroblasten. (A) Wirkungsweise des ERK BRET-Biosensors. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven der PMA-induzierten Änderung der ERK-Aktivität unter Verwendung der pEKAREV BRET-Sonde. XP6BE-Fibroblasten wurden vor der BRET-Messung 15 Minuten lang bei 37 °C mit zunehmender PMA-Konzentration aktiviert. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt ± SEM von 10 unabhängigen Experimenten dar, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Der pEC50 von PMA betrug 7,72 ± 0,15, während die maximale Wirksamkeit von PMA 0,178 ± 0,018 betrug. (C–E) Mit der pEKAREV BRET-Sonde transfizierte XP6BE-Fibroblastenzellen wurden 24 Stunden lang entweder kontinuierlich oder intermittierend (5 Min. ON/10 Min.) schein-exponiert oder 5G-modulierten 3,5 GHz bei 0,25, 1 oder 4 W/kg ausgesetzt AUS). Die Zellen wurden unter Verwendung zunehmender PMA-Konzentrationen unter Schein- oder RF-EMF-Exposition für die letzten 15 m aktiviert, bevor BRET-Messungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse in den Feldern CE stellen die Box- und Whisker-Diagramme der basalen BRET-Variation (C), der PMA-Potenzvariation (D) und der PMA-maximalen Wirksamkeitsvariation (E) zwischen den 5G RF-EMF-exponierten (Expo) und dar Scheinbedingungen sowohl im kontinuierlichen als auch im intermittierenden Belichtungsmodus. Die statistische Signifikanz der Ableitung aus der Nullhypothese (kein Unterschied zwischen Schein- und HF-EMF-Exposition) wurde mithilfe des Wilcoxon Signed Rank-Tests mit einer Stichprobe bewertet. n = 6–12 je nach Versuchsbedingungen. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01.

XP6BE-Fibroblasten, die diese RAS- und ERK-empfindlichen BRET-Sonden vorübergehend exprimieren, wurden daher 15 Minuten lang mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) belastet, einem bekannten Phorbolester, der Diacylglycerin nachahmt, was zu einer PKC-abhängigen Aktivierung von RAS und führt ERK42. Wie erwartet induzierte PMA einen konzentrationsabhängigen Anstieg des BRET, gemessen mit den BRET-Sonden RAS (Abb. 3B) und ERK (Abb. 4B). Darüber hinaus lagen die gemessenen EC50-Werte für beide BRET-Sonden im Bereich von mehreren zehn Nanomolaren, was erneut die hohe Empfindlichkeit unserer BRET-basierten Tests zur Überwachung der RAS- und ERK-Aktivierung zeigt.

Kontinuierliche oder intermittierende Exposition von XP6BE-Fibroblasten, die vorübergehend die RAS- und ERK-Sonden exprimieren, gegenüber einem 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signal für 24 Stunden hatte keinen Einfluss auf RAS und ERK-Basal-BRET (Abb. 3C und 4C, Tabellen 1 und 2) noch auf die PMA-Wirksamkeit ( Abb. 3D und 4D, Tabelle 3) oder maximale Wirksamkeit (Abb. 3E oder 4E, Tabelle 4) zur Aktivierung dieser Kinasen. Wir haben nur eine leichte Abnahme der PMA-Potenz zur Aktivierung von ERK in XP6BE-Fibroblasten gemessen, die 24 Stunden lang kontinuierlich bei einem SAR von 0,25 W/kg exponiert wurden (Abb. 4D, Tabelle 3).

Da wir schließlich wussten, dass die posttranslationale kovalente Addition von SUMO an PML, ein als SUMOylierung bekannter Prozess, ein Schlüsselereignis ist, das zur PML-Aktivierung und der Bildung von PML-NBs führt, verwendeten wir einen intermolekularen BRET-Assay26, um zu beurteilen, ob kontinuierliche oder intermittierende 5G- Die Exposition gegenüber einem modulierten 3,5-GHz-HF-EMF-Signal kann die PML-Aktivität beeinträchtigen. In diesem Assay haben wir das BRET-Signal zwischen einem N-terminal mit mNeonGreen markierten SUMO1-Protein und einem C-terminal mit nLuc markierten PMLIII-Protein gemessen (Abb. 5A). XP6BE-Fibroblasten, die vorübergehend mit PMLIII-nLuc/mNeonG-SUMO1-Expressionsvektoren transfiziert wurden, wurden daher mit Arsentrioxid (As2O3) in Kontakt gebracht, einem bekannten Auslöser von oxidativem Stress in Zellen43, der die PML-SUMOylierung effizient auslöst26,44. Wie erwartet erhöhte As2O3 dosisabhängig das BRET-Signal zwischen PMLIII-nLuc und mNeonG-SUMO1 in XP6BE-Fibroblastenzellen mit einem EC50 im Bereich von mehreren zehn Nanomolaren (Abb. 5B), was auf eine effiziente PML-SUMOylierung in diesen Zellen hinweist. Darüber hinaus wurden weder die basale PML-SUMOylierung noch die As2O3-Potenz oder die maximale Wirksamkeit zur Auslösung der PML-SUMOylierung beeinträchtigt, nachdem vorübergehend transfizierte XP6BE-Fibroblasten 24 Stunden lang einem 5G-modulierten 3,5-GHz-RF-EMF-Signal ausgesetzt wurden, unabhängig von der getesteten SAR (Abb. 5C–E). ). Wir haben jedoch eine leichte, aber reproduktive Abnahme der basalen PML-SUMOylierung gemessen, wenn XP6BE-Fibroblasten 24 Stunden lang kontinuierlich bei 4 W/kg exponiert wurden (Abb. 5C). Diese Variation machte weniger als 3,5 % des basalen PML-BRET-Signals (Tabelle 1) und 14,9 % der maximalen As2O3-Wirksamkeit (in absoluten Zahlen) aus (Tabelle 2). Auch eine kontinuierliche Exposition über 24 Stunden veränderte nicht die Wirksamkeit von As2O3, um die PML-SUMOylierung auszulösen (Abb. 5D, Tabelle 3), führte jedoch zu einer leichten Abnahme der maximalen Wirksamkeit von As2O3 im Vergleich zur Erkrankung (Abb. 5E, Tabelle 4).

Einfluss einer kontinuierlichen oder intermittierenden 5G-EMF-Exposition auf die PML-SUMOylierung in XP6BE-Hautfibroblasten. (A) Schematische Beschreibung der intermolekularen BRET-Assays zum Nachweis der PML-SUMOylierung. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven der As2O3-induzierten PML-SUMOylierung unter Verwendung des intermolekularen PML-nLuc/mNeonGreen-SUMO1-Assays. XP6BE-Fibroblasten wurden vor der BRET-Messung 4 Stunden lang bei 37 °C mit zunehmender As2O3-Konzentration aktiviert. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt ± SEM von 10 unabhängigen Experimenten dar, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Der pEC50 von As2O3 betrug 7,19 ± 0,15, während die maximale Wirksamkeit von PMA 0,161 ± 0,014 betrug. (C–E) XP6BE-Fibroblasten, die mit dem für PML-nLuc und mNeonGreen-SUMO1 kodierenden Säugetier-Expressionsvektor cotransfiziert waren, wurden entweder kontinuierlich oder 24 Stunden lang schein-exponiert oder 5G-moduliertem 3,5 GHz bei 0,25, 1 oder 4 W/kg ausgesetzt intermittierend (5 Min. EIN/10 Min. AUS). Die Zellen wurden in den letzten 4 Stunden vor der BRET-Messung mit steigenden Konzentrationen von As2O3 unter Schein- oder RF-EMF-Exposition aktiviert. Die Ergebnisse in den Feldern CE stellen die Box- und Whisker-Diagramme der basalen BRET-Variation (C), der As2O3-Potenzvariation (D) und der As2O3-maximalen Wirksamkeitsvariation (E) zwischen den 5G RF-EMF-exponierten (Expo) und dar Scheinbedingungen sowohl im kontinuierlichen als auch im intermittierenden Belichtungsmodus. Die statistische Signifikanz der Ableitung aus der Nullhypothese (kein Unterschied zwischen Schein- und HF-EMF-Exposition) wurde mithilfe des Wilcoxon Signed Rank-Tests mit einer Stichprobe bewertet. n = 6–12 je nach Versuchsbedingungen. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01.

Als nächstes beurteilten wir, ob wir keinen potenziellen Effekt der HF-Exposition übersehen hatten, der in den kurzen Zeiträumen zwischen dem Ende der Exposition und dem Abschluss der BRET-Messung (weniger als 5 Minuten) verschwunden sein könnte. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurde den Zellkulturvertiefungen Coelenterazin H zugesetzt, um die Biolumineszenzreaktion 10 Minuten vor dem Ende der Exposition der Zellen gegenüber einem 5G-modulierten 3,5-GHz-Signal, das kontinuierlich mit 4 W/kg emittiert wurde, zu starten. Dann haben wir mithilfe einer optischen Faser das BRET-Verhältnis in Echtzeit während der letzten fünf Minuten der 24-stündigen HF-EMF-Expositionsperiode aus der Ferne gemessen und die Messung während der nächsten fünf Minuten ohne HF-Exposition fortgesetzt. Wie in Abb. 6 dargestellt, haben wir unabhängig von der betrachteten BRET-Sonde und unabhängig davon, ob eine chemische Aktivierung vorliegt oder nicht, nach dem Ende der HF-Exposition keine Variation des BRET-Signals festgestellt, wodurch die zuvor erzielten Ergebnisse bestätigt wurden.

Echtzeitüberwachung der BRET-Variation nach der Abschaltung des RF-EMF. HEK293T-Zellen, die entweder mit den BRET-Sonden HSF1 (A), RAS (B), ERK (C) oder PML (D) transfiziert wurden, wurden 24 Stunden lang einem 5G-modulierten 3,5 GHz bei 4 W/kg ausgesetzt und entweder behandelt oder behandelt mit 1 µM PMA, 10 µM As2O3 oder 10 µM MG132 gemäß dem in Abb. 1A angegebenen Zeitplan. Coelenterazin H wurde 10 Minuten vor dem Ende der RF-EMF-Exposition in das Zellkulturmedium injiziert. BRET-Signale wurden in den letzten 5 Minuten vor dem Ende der HF-EMF-Exposition und in den nächsten 5 Minuten nach dem Ende der HF-EMF-Exposition aus der Ferne gemessen. Für jede BRET-Sonde wird die Kinetik der BRET-Signalentwicklung in scheinbehandelten und medikamentenbehandelten Zellen gezeigt und stellt den Durchschnitt von 3–4 unabhängigen Experimenten dar.

In einem weiteren Versuch, die mögliche Wirkung des 5G-Signals auf Hautzellen zu untersuchen und da die obere Hautschicht (Epidermis) hauptsächlich aus Keratinozyten besteht, führten wir eine neue Reihe von Experimenten mit der HaCaT-Keratinozyten-Zelllinie durch, um zu beurteilen, ob a Eine 24-stündige kontinuierliche Exposition gegenüber 5G-moduliertem 3,5-GHz-HF-EMF kann Auswirkungen auf HSF1-, RAS-, ERK- und PML-Aktivitäten haben. HaCaT-Zellen, die vorübergehend mit den BRET-Sonden zur Untersuchung von HSF1, RAS, ERK und PMLIII transfiziert wurden, wurden nach Schein- oder kontinuierlichen Tests mit steigenden Konzentrationen von MG132 (für HSF1), PMA (für RAS und ERK) und As2O3 (für PML) provoziert. Exposition gegenüber 5G-moduliertem 3,5-GHz-HF-EMF für 24 Stunden bei drei verschiedenen SAR-Werten von 0,25, 1 und 4 W/kg. Für jede Versuchsbedingung wurden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt (siehe Supp. Abb. 2 für die Kurven, die aus der Schein-Expositionsbedingung abgeleitet wurden). Daher wurden der BRET-Grundwert jeder Sonde sowie die Stärke und maximale Wirksamkeit jedes chemischen Mittels berechnet, und die Variation jedes Parameters zwischen schein-exponierten und RF-EMF-exponierten Bedingungen wurde in Abb. 7 dargestellt. Wir fanden keinen Unterschied zwischen schein- und exponierten Bedingungen Bedingungen, unabhängig vom molekularen Ziel, der SAR oder der betrachteten Metrik. Die einzige Ausnahme war ein leichter Anstieg der maximalen PMA-Wirksamkeit zur Aktivierung von ERK, wenn HaCaT-Zellen mit 1 W/kg exponiert wurden.

Auswirkung einer kontinuierlichen oder intermittierenden 5G-HF-EMF-Exposition auf HSF1-, ERK-, RAS- und PML-Aktivitäten in HaCaT-Keratinozyten. HaCaT-Keratinozytenzellen, die vorübergehend HSF1-, ERK-, RAS- und PML-Konstrukte exprimieren, wurden 24 Stunden lang entweder kontinuierlich oder intermittierend (5 Min. EIN/10 Min. AUS) schein-exponiert oder 5G-modulierten 3,5 GHz bei 0,25, 1 oder 4 W/kg ausgesetzt ). Die Zellen wurden unter Verwendung steigender Konzentrationen von entweder MG132 (HSF1), PMA (RAS und ERK) oder As2O3 (PML) unter Schein- oder RF-EMF-Exposition für die letzten 18 Stunden (HSF1), 15 Minuten (RAS und ERK) oder 4 Stunden aktiviert (PML) des HF-EMF-Expositionszeitraums. Anschließend wurde die HF-EMF-Exposition abgeschaltet und die BRET-Signale sofort gemessen. Für jede Dosis-Wirkungs-Kurve wurden das basale BRET-Signal, die Wirksamkeit und die maximale Wirksamkeit des aktivierenden chemischen Mittels abgeleitet und als Boxen- und Whisker-Diagramme der Variation zwischen den 5G RF-EMF-exponierten (Expo)- und Schein-Bedingungen sowohl unter kontinuierlichen als auch unter kontinuierlichen Bedingungen berichtet intermittierender Belichtungsmodus. Die statistische Signifikanz der Ableitung aus der Nullhypothese (kein Unterschied zwischen Schein- und HF-EMF-Exposition) wurde mithilfe des Wilcoxon Signed Rank-Tests mit einer Stichprobe bewertet. n = 6–13 je nach Versuchsbedingungen. ns nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01.

In dieser Studie untersuchten wir, ob eine kontinuierliche oder intermittierende (5 Min. EIN / 10 Min. AUS) Exposition gegenüber einem 5G-modulierten 3,5-GHz-HF-EMF-Signal bei 0,25, 1 und 4 W/kg über 24 Stunden unter isothermen Bedingungen Auswirkungen auf die Fibroblasten der menschlichen Haut hat und die Stressreaktion der Keratinozytenzellen auf molekularer Ebene. Unter Verwendung unserer eigenen bestehenden BRET-basierten molekularen Sonden haben wir uns auf HSF1-, RAS/ERK- und PML-Proteine konzentriert, die an der Schnittstelle verschiedener molekularer Signalwege stehen und eine ordnungsgemäße Zellreaktion auf eine Vielzahl von Umweltbelastungen, einschließlich thermischer Schädigung und oxidativem Stress, gewährleisten und proteotoxischer Stress38. Wir untersuchten, ob die 5G-Signalexposition entweder die basale oder die chemisch aktivierte Aktivität für jeden dieser molekularen Marker für zellulären Stress beeinflusste.

Wir fanden heraus, dass der basale HSF1-BRET-Spiegel verringert wurde, wenn XP6BE-Fibroblastenzellen 24 Stunden lang einem kontinuierlichen und intermittierenden 5G-Signal bei 0,25 W/kg bzw. 24 Stunden lang einem intermittierenden 5G-Signal bei 1 W/kg ausgesetzt wurden. Bei 1 W/kg wurde keine Änderung des HSF1-Basal-BRET-Signals festgestellt, wenn ein kontinuierliches Signal verwendet wurde oder wenn die Zellen kontinuierlich oder intermittierend bei 4 W/kg exponiert wurden.

Auf den ersten Blick mag die durch HF-EMF induzierte Abnahme des basalen HSF1-BRET-Signals relativ gering erscheinen, da sie im Scheinexperiment nur 6–11 % des basalen HSF1-BRET-Signals ausmacht (Abb. 2B). Da jedoch die chemische Aktivierung mit MG132 den basalen BRET-Wert nur um 0,1 BRET-Einheiten erhöhte (d. h. einen Anstieg des basalen BRET um 14 %) (Abb. 2B), scheint die Wirkung der 5G-HF-EMF-Exposition in Bezug auf absolute Werte wichtig zu sein. Interessanterweise stimmen diese Ergebnisse mit denen überein, die wir zuvor mit HEK293T-Zellen erhalten haben, die 24 Stunden lang entweder einem unmodulierten (kontinuierlichen Wellensignal, CW) oder einem GSM-modulierten 1,8-GHz-Signal ausgesetzt waren13. In dieser früheren Arbeit verringerte die HF-EMF-Exposition die HSF1-Grundaktivität bei dem getesteten niedrigeren SAR (1,5 W/kg) leicht, bei einem höheren SAR (4 W/kg) jedoch nicht. Ob die Wirkung von RF-EMF auf basales HSF1 die physiologische HSF1-abhängige Stressreaktion in RF-EMF-exponierten Organismen beeinflussen kann, muss noch ermittelt werden. Während wir in dieser früheren In-vitro-Studie festgestellt haben, dass die maximale Wirksamkeit von MG132 zur Auslösung der HSF1-Trimerisierung in HEK293T-Zellen nach 24-stündiger Exposition gegenüber CW- oder GSM-Signalen bei 1,5 W/kg und einem CW-Signal bei 6 W/kg13 erhöht war, haben wir dies getan konnten keine Variation der MG132-Potenz oder -Wirksamkeit feststellen, die die HSF1-Aktivierung nach einer 5G-HF-EMF-Exposition auslöst (Abb. 2).

Unter Berücksichtigung der anderen BRET-Tests, die an Hautfibroblasten durchgeführt wurden, stellten wir nur eine leichte Verschiebung nach links fest, weniger als ein Viertel eines Logarithmus, der PMA-Wirksamkeit zur Aktivierung von ERK bei 0,25 W/kg und eine geringfügige Verringerung der As2O3-Wirksamkeit, um die PML-SUMOylierung auszulösen, aber nur, wenn die Zellen kontinuierlich exponiert waren. Bei 5G-HF-EMF-exponierten Fibroblasten konnte kein anderer HF-induzierter Effekt festgestellt werden, unabhängig von der verwendeten molekularen Sonde und unabhängig vom SAR oder der verwendeten Signalhülle. Schließlich konnten wir bei allen an Keratinozyten durchgeführten Tests nur einen Anstieg der PMA-Wirksamkeit zur Aktivierung von ERK um etwa 37 % bei 1 W/kg feststellen, nicht jedoch bei 0,25 oder 4 W/kg. Wichtig ist, dass nach dem Ende der RF-EMF-Exposition keine Änderungen in der BRET-Messung festgestellt wurden, als das BRET-Signal in Echtzeit in Fibroblastenzellen abgelesen wurde, die 24 Stunden lang kontinuierlich dem 5G-modulierten 3,5 GHz bei 4 W/kg ausgesetzt waren - Dies führt zu einer möglichen Verzerrung aufgrund der Zeit, die zum Ablesen unseres BRET-Signals in 96-Well-Platten nach dem Ende der RF-EMF-Exposition benötigt wird.

Insgesamt können diese Ergebnisse auf mehreren Ebenen rätselhaft erscheinen. In Anbetracht der verwendeten Zelltypen ist es bemerkenswert, dass eine HF-EMF-Exposition mit zwei verschiedenen Trägerwellen (1,8 und 3,5 GHz) und mit unterschiedlicher Signalmodulation (CW- oder GSM-Modulation in unserer vorherigen Studie und 5G-Modulation in der vorliegenden Studie) möglich ist Die HSF1-Basalaktivität wird in embryonalen Nierenzellen HEK293T13 und XP6BE-Hautfibroblasten kontinuierlich verringert (Abb. 2), jedoch nicht in HaCaT-Keratinozyten (Abb. 7). In ähnlicher Weise haben wir festgestellt, dass die maximale Wirksamkeit von PMA zur Aktivierung von ERK (i) abnahm, wenn HEK293T-Zellen einem CW- oder einem GSM-modulierten 1,8-GHz-Signal ausgesetzt wurden, (ii) bei Keratinozyten zunahm, (iii) jedoch bei 5G RF nicht beeinträchtigt wurde. EMF-exponierte Hautfibroblasten. Schließlich war die maximale Wirksamkeit von As2O3 zur Auslösung der PML-SUMOylierung bei Hautfibroblasten bei kontinuierlicher Exposition leicht verringert, wurde jedoch bei Keratinozyten nicht verändert.

Mehrere Autoren haben bereits über qualitative oder quantitative Variationen einiger biomolekularer Effekte berichtet, die in verschiedenen Zelllinien induziert werden, nachdem sie RF-EMF-Signalen im GHz-Bereich unter identischen experimentellen Bedingungen ausgesetzt wurden45,46,47. Obwohl durchaus davon ausgegangen wird, dass verschiedene Zelltypen unterschiedlich auf denselben Reiz reagieren können, hat unseres Wissens noch kein Forschungsteam geklärt, warum und wie sich schwache HF-EMF auf lebende Materie auswirken können. Neben dem Fehlen nicht-thermischer Mechanismen ist es auch faszinierend, dass die wenigen hier festgestellten HF-EMF-induzierten Effekte auf HSF1-, ERK- und PML-Aktivitäten keinem klassischen Dosis-Wirkungs-Profil folgen. Beispielsweise konnte die durch RF-EMF induzierte Hemmung der HSF-Basalaktivität in menschlichen Hautfibroblasten sowohl bei intermittierender als auch bei kontinuierlicher Exposition nur bei 0,25 W/kg, nicht jedoch bei 4 W/kg nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise gab es bei 1 W/kg keine Veränderung des HSF1-Basal-BRET, wenn die Zellen kontinuierlich exponiert wurden, während der HSF1-Basal-BRET weiter abnahm, wenn die Zellen intermittierend exponiert wurden. In ähnlicher Weise war die maximale Wirksamkeit von PMA zur Aktivierung von ERK in Keratinozyten bei 1 W/kg erhöht, jedoch weder bei 0,25 W/kg noch bei 4 W/kg (Abb. 5). Lediglich die maximale Wirksamkeit von As2O3 zur Auslösung der PML-SUMOylierung schien bei kontinuierlicher Exposition dosisabhängig mit der SAR abzunehmen, das Ausmaß dieses Effekts war jedoch gering (Tabelle 4).

Kann eine HF-EMF-Exposition bei niedrigen Pegeln einen nicht-thermischen biologischen Effekt hervorrufen, während eine HF-EMF-Exposition bei höheren Pegeln möglicherweise nicht auftritt? Mehrere Autoren in diesem Forschungsbereich haben bereits über den sogenannten „Fenstereffekt“ berichtet, bei dem EMF-Exposition bei bestimmten Intensitäten einen bestimmten biologischen Effekt hervorruft, der bei EMF-Exposition bei niedrigeren oder höheren Intensitäten nicht nachgewiesen werden konnte48,49. Leider wurden später keine weiteren experimentellen Beweise für diesen Fenstereffekt veröffentlicht und dementsprechend lieferten die Autoren auch keine Erklärung zum zugrunde liegenden molekularen Mechanismus.

In jüngerer Zeit haben Pooam et al. beriefen sich auf einen hormetischen Dosis-Wirkungs-Effekt, um zu erklären, dass die ROS-Produktion in HEK293T-Zellen, die 1,8 GHz RF-EMF ausgesetzt sind, bei einer mittleren Signalamplitude maximal ist50. Hormesis ist ein toxikologisches Konzept, das durch eine stimulierte biologische Reaktion gekennzeichnet ist, wenn es einer geringen, subtoxischen Menge eines Stressors ausgesetzt wird, und durch die schädlichen Auswirkungen hoher, toxischer Mengen desselben Stressors51. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine beeindruckende Reihe zytoprotektiver molekularer Mechanismen und Signaltransduktionswege auf hormetische Weise reagieren, einschließlich der Aktivierung von HSF1 und ERK52,53. Daher muss genauer untersucht werden, ob eine HF-EMF-Exposition allein oder in Kombination mit einem chemischen Aktivierungsmittel eine hormetische Reaktion auf die HSF1- oder ERK-Aktivität auslösen oder verstärken könnte. Interessanterweise ist Hormesis auch ein zeitabhängiger Prozess54. Bemerkenswert ist, dass ein zeitabhängiger hormetischer Effekt vorgeschlagen wurde, um zu erklären, dass eine kurze Exposition (1 Stunde) bei 1,8 GHz RF-EMF bei einem durchschnittlichen SAR von 4,0 W/kg die DNA-Fragmentierung in embryonalen Fibroblasten von Mäusen induziert, während eine längere Exposition (36 Stunden) eine DNA-Fragmentierung in embryonalen Fibroblasten von Mäusen induziert ) verringerte die DNA-Fragmentierung auf ein geringeres Niveau als bei der Scheinbedingung55. Da wir nur eine Expositionszeit (24 Stunden) getestet haben, wird es daher interessant sein, diese Experimente zu wiederholen, um mögliche zeitabhängige Variationen der hier festgestellten Effekte zu bewerten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere BRET-Studie keine schlüssigen Beweise dafür liefert, dass molekulare Effekte auftreten können, wenn Hautzellen 24 Stunden lang einem 5G-HF-EMF-Signal (3,5 GHz) ausgesetzt werden, selbst bei Werten über den ICNIRP-Richtlinien für öffentliche Fernfeldexposition (0,08). W/Kg). Es wurden nur wenige statistisch signifikante Veränderungen festgestellt, die von (i) der verwendeten molekularen Sonde, (ii) der Art der verwendeten Zellen, (iii) der Anwesenheit eines aktivierenden chemischen Mittels abhängen, mit einer höchstwahrscheinlich zeitlichen und dosisabhängigen Wirkung. Abhängigkeit und (iv) die Eigenschaften der HF-EMF-Exposition wie SAR, Frequenz oder Modulation der Trägerwelle. Da wir mehr als 100 verschiedene experimentelle Parameter verwendeten und alle bis auf einen der erkannten Effekte einem Fehlerrisiko von 5 % entsprachen, war statistisch zu erwarten, dass einige falsch positive Daten vorliegen würden. Zu einer ähnlichen Schlussfolgerung kamen wir, als wir die Wirkung verschiedener 1,8-GHz-Signale auf primäre Gehirnzellkulturen und Neuroblastomzelllinien mithilfe markierungsfreier Techniken untersuchten56. Abgesehen von der Wirkung von RF-EMF auf die HSF1-Basalaktivität, die möglicherweise weitere Untersuchungen erfordert, haben wir daher keine ausreichenden Beweise für die physiologische Wirkung der getesteten RF-EMF allein oder in Kombination mit Chemikalien gefunden.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Bernard Veyret für seine klugen Ratschläge und das Korrekturlesen des Manuskripts.

Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führte, wurde von der französischen Agentur für Lebensmittel-, Umwelt- und Arbeitsschutz (ANSES) im Rahmen der Fördervereinbarung EST-19 RF-18 (das 5G-SAMU-Projekt) und vom Regionalrat New Aquitaine im Rahmen eines Zuschusses finanziert Vereinbarung AAPR2020A-2019-8140010 (Das PHYSTRIG-Projekt).

Universität Bordeaux, CNRS, IMS-Labor, UMR5218, F-33400, Talence, Frankreich

Alexandre Joushomme, Lorenza Patrignoni, Anne Canovi, Yann Loïck Chappe, Florence Poulletier De Gannes, Annabelle Hurtier, André Garenne, Isabelle Lagroye und Yann Percherancier

Universität Limoges, CNRS, XLIM, UMR 7252, F-87000, Limoges, Frankreich

Rosa Orlacchio, Philippe Lévêque und Delia Arnaud-Cormos

Institut Universitaire de France (IUF), F-75005, Paris, Frankreich

Delia Arnaud-Cormos

Forschungsuniversität Paris Sciences et Lettres, F-75006, Paris, Frankreich

Isabelle Lagroye

Universität Bordeaux, INSERM, BMGIC-Labor, UMR1035, F-33000, Bordeaux, Frankreich

Francois Moisan & Muriel Cario

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YP konzipierte und gestaltete die Studie. PL, RO und DAC entwarfen das Belichtungssystem und führten die elektromagnetische Dosimetrie durch. AJ, LP, AC, YLC, FPDG, AH, FM, MC und YP sammelten und stellten die Daten zusammen. AG führte die statistische Auswertung der Ergebnisse durch. YP, IL, DAC und PL haben das Manuskript geschrieben. Alle Co-Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yann Percherancier.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Joushomme, A., Orlacchio, R., Patrignoni, L. et al. Auswirkungen von 5G-modulierten 3,5-GHz-Hochfrequenzfeld-Expositionen auf die HSF1-, RAS-, ERK- und PML-Aktivierung in lebenden Fibroblasten und Keratinozytenzellen. Sci Rep 13, 8305 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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Eingegangen: 27. Oktober 2022

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 23. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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